Способ получения комплекса протеолитических ферментов Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение относится к ферментной про.мышленности.

Ближайши.м техническим решением по своей сущности и достигаемому положительному эффекту является способ получения комплекса протеолитических ферментов, включающий гомогенизацию исходного сырья - гепатопанкреас криветок, осаждение комплекса ферментов сульфатом аммония и его выделение, например, путе.м гельфильтрации и ионооб.менной хроматографии, центрифугирования осадка с последующем диализом и высушиванием il.

Однако в известиом способе получают комплекс ферментов, состоящий из трех ферментов карбоксипептидаз А и Б, а также трипоиноподобного фермента.

Цель изобретения - увеличение количества ферментов, входящих в комплекс и обладающих широким Спектром действия на белок и белоксодержащие биополимеры, расширение сырьевой базы и утилизация промышленных отходов.

Для этого в предложенном способе в качестве исходного сырья используют гепатопанкреас промысловых видов крабов Paraiithoides camtchatica или Paraiithoides platypus, или Paraiithoides brevipes, или Chionoecets opilio, или Telmessus cheiraqonus, или Erimacrus beckii.

гомогеиизирзют данное сырье в водном растворе при соотношении ткань;вода, равном 1 ; 3, гомогенат отстаивают и полученную при этом жидкую фазу очищают от примесей путем введения сульфата аммония до насыщения 0,3, отделения полученного при этом осадка и фильтрации жидкой фазы, после чего осаждают комплекс ферментов из очищенного раствора при его насыщении сульфатом

аммония до 0,8.

Предложенный способ заключается в следующем.

Гепатопанкреас промысловых видов крабов, таких как Paraiithoides camtchatica, Paralithoides platypus, Paraiithoides brevipes, Chionoecets opilio, Telmessus cheiraqonus, Erimacrus beckii, гомогенизируют в водном растворе при соотношении ткань:вода, равном 1 : 3, затем гомогенат отстаивают и вводят сульфат аммония до насыщения 0,3. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием, а жидкую фазу фильтруют через слой ваты. После этого к полученному раствору добавляют сульфат а.ммония до насыщения 0,8, гомогенат отстаивают и центрифуг 1руюг. Осадок, содержащий комплекс ферментов, растворяют в дистиллированной воде, диализуют и лиофилизируют. Все оиерации осуществляют при 4- . Комплекс ферментов, полученный по cnocoiiy, coACpi/i iiT Ть-ичс:-., карбоксниептцдазы А п Б, лейц 1иалИ1)10ие:тп1дазу, щелочные и нейтральные нротсазы. Ич 1 кг гепатонанкреа€ крабов получают 20 г ллофильного порсмика комплекса ферментов. Пример. 300 г генатонанкреас краба Pavaiiihoides canitscliaiica измельчают при 1000 об/мин в гомогенизаторе в течение 5 мин при соотно) ткань; вода, равном 1:3. Го огенат отстаивают Б течение 6 ч, затем при Hepe.MeLHiiBaHiui добав.чяют но частям твердый сульфат а.ммоиия до пасыи1ення 0,3, т. с. 158,426 г. После добавления носледней HopiiiiH сульфата аммонии гомогеиаг оставляют стоять в теченне 4 ч при 4°С. Осадок отделяют центрифугированием при 20000 об/ /М1ип в течение 1 ч. Полученную жндкую фазу фильтруют через слой ваты для удаления нерастворимых лнпидов. К 825 мл нрозрачного раствора добавляют но частям твердый сульфат аммония до насыщения 0,8, т. е. 270г. Гомогеиат отстаивают в течеиие 10 ч нрн 4°С и центрифугируют. Полученный осадок растворяют в минимальном количестве дистиллированной воды (200 мл) и лталее диализуют через целлофан в течение 1 сут, нрнчем по истечении иервых 3 ч от начала диализа ироводят перемешивание на магнитной меиталке. Вначале периодически каждый час используют новую порцию дистиллированной воды. Отдиализоваииый раствор лиофильио высуHJHBEioT. Выход ирепарата по активности 68, Специфическая удельная актнвность, выраженная в едмг, равна 102,5, где за едииццу актнвиости нрннято количество фермеитлого препарата, освобождаюп1,ее 1 мпкромопь амниокислоты в минуту (калибровочная кривая иостроена по тирозину). Форм у л а изо б I) т и 1. Способ по; учеиия коми.текса iipoieo.nrrjiческих ферментов, включающий гомогенизацию исходного сырья, осаждение комплекса ферментов сульфатом аммония н его выделение, отличающийся тем, что, с целью увеличения количества ферментов, входящих в комн.текс, расншрения сырьевой базы и утнлизаднн промышленных , в качестве исходио:ч) сырья цс :ользу1от геиатоианкреас нромысл.овых видов крабов Paralithoidcs camicliatica, или Paralithoides р1а1урц8, или Рагаlilhoides brcvipes, или Chionoecels opilio, или Telrnessus cheiraqonus, или Erimacrus beekii, при этом гомогенизацию сырья осуществ-тяют в водном растворе при cooTHOHieHini ткань : : вода, равном 1:3, после чего гомогенат отетанвают н нолученную нрн этом жидкую фазу очищают от нрнмесей, а оса}кденне комплекса ферментов сульфатом ам.моння осуществляют из очищенного раствора. 2.Способ по н. 1, отличающийся тем, что очнстку жидкой фазы от примесей осуи1ествляют путем введення сульфата аммоннядо насыщения 0,3, отделения полученного при этом осадка н фильтрации жидкой фазы. 3.Способ по п. 1, от л и ч а ю щ н и с я тем, что осаждают комнлекс ферментов из очищениого раствор-а при иасыщенпи его сульфатом аммония до 0,8. 11сточники информации, нри)1ятые во внимание ири экспертизе 1. Gates В. and Travis 1 Purification and Characterization of Carboxypeptidases A and В from u tiie white Shrimp Penqens setiferus cBiochemistry, 1973, 1 r, N° 10, 1867-1874.