Способ иммобилизации ферментов Советский патент 1977 года по МПК C12N11/08 A61K38/43 

1

Изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, которые могу г Найти широкое применение в иищевой, химической, микробиологической промышленности, а также в лабораторной и медицинской практике.

Известно большое количество способов иммобилизации ферментов на водонерастворимых носителях. В частности, известен способ иммобилизации ферментов на сополимере этилена и маленнового ангидрида 1.

Иедостатком этого способа является значительная солюбилизация иммобилизованного фермента и ограниченность типов применяемых носителей.

Предложен способ получения иммобилизованных ферментов на карбоксилсодержаш.их полимерах посредством образования ковалентной связи между карбоксильной группой матрицы и свободными функциональными группами белков. Отличительным признаком метода является предварительная активация карбоксильных групп носителя. Активация достигается обработкой носителя, содержащего свободные карбоксильные пруипы, хлористым тионилом, а затем имидазолом. Иммобилизацию фермента проводят путем контактирования раствора фермента с активированным носителем. Предложенный способ введения имидазола не пригоден для углеводсодержащих

полимеров, однако, если использовать мягкие активирующие реагенты, такие, например, как карбонилдиимидазол, ввести и.мидазольный остаток и в такого типа носители. Активированный носитель содержит ацилимидазольные группы

CH N

/

I

.N

-СН--СИ

которые могут вступать в реакцию ацилирования со свободными функциональными группами белков (ПзК-группы, HS-группы цистеина, НО-груопы тирозина и т. д.).

Пример 1. Получение активированного носителя.

К 12 г полиметакриловой смолы - Amberlite CG-50, ТИ1П 11 («L. Р. С. Chemicals Dyes, Великобритания) в 100 мл абсолютного хлороформа (бензола) приливают 12 .мл хлористого тионила и смесь кипятят в течение 3- 5 час до прекращения выделения хлористо,го водорода. Избыток хлористого тионила и растворитель отгоняют, затем последовательно дважды добавляют по 50 мл абсолютного хлороформа (бензола) и упаривают смесь досуха. К сухой смоле прибавляют 5 г имидазола, 60 мл хлороформа и 10 мл триэтиламина. Реакционную смесь кипятят с обратным холодильником в течение 4 час. Смесь переносят на фильтр и тщательно отмывают от избытка реагентов а.бсолютным хлороформо.м. Слегка желтоватый порошок активированното носителя при хранении в вакуум-эксикаторе над PaOs ло крайней мере в течение 2 месяцев сохраняет способность реагировать с ферментами. Согласно результатам микроанализа полученная смола содержит 1,76% азота, т. е. приблизительно 10% свободных карбоксильных трупп вступает в реакцию с имидазолом. Пример 2. Иммобилизация а-химотрипсина. 1 г активированното носителя тщательно промывают 3 М раствором NaCl в ацетатном буфере (рН 5,5), а затем буфером (ацетатным 50 мм или трис-НС, 0,1 М) до рН в про.мывных водах, при котором предполагают проводить им.мобилизацию. К смоле, подвергнутой такой обработке, прибавляют 250 мг а-химотрипсина в 6-10 мл соответствующего буфера. Реакционную смесь инкубируют при перемешивании в течение 3 часов при 25°С или 18 час при 4°С. После инкубации реакционную смесь переносят на фильтр и многократно прОМЫвают 3 М раствором NaCl в ацетатном буфере до полного удаления белка, связавшегося со смолой за счет ионообменной сорбции. Количество им,мобил.изованнаго а-химотрипсина (мГ/г носителя), определенное по скорости гидролиза «-нитрофенилацетата при трех значениях рН 5,5, 6,7, 8,5 составило соответственно 3-4, 22, 40-50. Пример 3. Им.мобилизация фосфодиэстеразы яда гюрзы. К 1 г активированного носителя, обработанного, как в примере 2, приливают раствор фосфодиэстеразы с удельной активностью 25 ед/мл. Общее количество фермента -в инкубационной смеси приблизительно 100 ед. После инкубации полученный препарат промывают, как в примере 2. Содержание активного фермента на носителе при проведении иммобилизации при рН 6,7 составляет приблизительно 3% от взятого в реакцию количества. Формула изобретения Способ иммобилизации ферментов путем нанесения фермента на носитель - карбоксилсод ержащий полимер, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации, носитель предварительно активируют хлористым тионилом, а затем имидазолом. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент США № 3616229, кл. 195-63, 197 (прототип).