Способ подготовки сыворотки для диагностики риккетсиозов Советский патент 1977 года по МПК C12K5/00 

(54) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗОВ

лению, контролю и примененгоо Волынского ряккетсиального антигена для реакции связывания комплемеитаот 1964 года, подвергают коныгировапию с флюорохромом-изотнацианатом флюиресцеина, Коньюгацию л ывидят в омеси 0,5М карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с 0,9%-ным раствором хлористого натрия при постоянном перемешивании в течение 18 час при температуре 4 После конъюгации навесь меченых риккетсий отмывают трехкратно в 0, растворе {забуференном) хлористого натрия с последующим центрифугированием при ЮОООоб/ми в течение 30 мин. После треаъего де рифугирования полученный осадок мече;1ых рнккетсий взвешивают в дистиллированной воде и стандартизуют методом прямш о счета меченых риккетсий в люминеоцеитном микроскопе. Концентрация меченых риккетсий доводится до 1,5 млрд в 1 мл. К полученной стандартизованной взвеси меченых риккетсий добавляют наполнитель следующего состава: сахароза 1,5%, нормалная инактивированная сыворотка кролика 0,1% Приготовленный диагностикум разливают в ампулы по 0,5 М7 и подвергают лиофильному высушиванию по режиму комплемента, применяемому в производстве биопрепаратов.

Перед постановкой реакции микроагглю- тииации диагпостикум разводят дистиллироBannoii водой в объеме, указанном на этикетке ампулы. Готовят последовательные двухкратные разведения исследуемой сы. воротки на физиологическом растворе (рН 7,0-7,2); на рифленое предметное, стекло, разделенное на 8-10 квадратов, с помощью туберкулинового шприца с тонкой иглой наносят на каждый квадрат стекла по капле каждого разведения сыворотки, начиная с большего. Другим туберкулиновым шприцем с тонкой иглой к капле каждого разведения исследуемой сыворотки добавляют ISO капле люминесцирующего днагности кума Квинтана. Параллельно на этом же стекле ставят контроли; 1-и - на отсутст- вио спонтанной агглютинации - к калле физиологического раствора добавляют каплю диагностикума; 2-й - на специфичность к капле иммунной гетерологичной сыворотки Провачека, взятой в том же начальном разведении,что и исследуемая сыворотка,добавляют каплю люминесцирующего диагностикума Квинтана, Взаимодействие антигена с антителом происходит во влажной камере, помещенной на 2 час в термостат при температуре 37°С. После этого стекла высушивают, и они готовы для исследования.

Учет результатов реакции проводят в поле зрения люминесцентного микроскопа (объектив 9О, 1жуляр 7, светофильтры :

СЗС-24-4, УФС6-5, БС-8-2) или обычного микроскопа, снабженного люминеснентйым осветителем ОК-17.

При просмотре препаратов в поле зрения микроскопа выявляются ярко-чзеленые тела риккетсий на общем фоне черного цвета. При поломсительных результатах реакции риккетсий сформированы в агглютинаты различной величины. При этом размеры образующихся агглютинатов, как правил о, обратно пропорциопальны разведению исследуемой сыворотки.

Оценка результатов реакции проводич-ся по четырехкрестпой системе при условии просмотра не менее 8-10 полей зрения препарата: -и-и- - все просмотренные поля зрения заполнены, преимущественно, крупными агглютинатами и незначительным числом отдельно расположенных риккетсий; + + все просмотренные поля зрения заполнены, главным образом, агглютинатами средней вел1гчины и умеренным количеством отдельно расположенных ряккетсий; + + - все просмотренные поля зрения заполнены в основном мелкими аг- глютинатами и значительным числом отдельно расположенных риккетсий; + - все просмотренные поля зрения заполнены отдельно расположенными рд1ккетх;иями н единичными мелкими агглютлнатами.

При отрицательных результатах реакции риккетсий во всех про ;мотренных полях зрения располагаютсн отдельно.

Чтение и учет реакции начписются с кон- тролей. Во всех контролях должны б1лть получены отрицательные результат..

Реакция считается положительной интенсивности м кроа т-лют 1на 1 П1 к разведениях исследуемо ) сьнюротк не менее, чем на 3+. При aiTJ OTii ianHii на 2+ суисдение о специфической риродо а Т/ ютлиата следует считать сомнитель Ь м, Титр исследуемой сыворогк 1 соотоеrciHyoT максимальному ее разведешио, в когором интенсивность аГГЛЮГИИа 1 1И

щего диагностикума оценивается не ниже, чем на 3+. При атом необходимо учитывать, что в соответствии с условиями постановки иммунофлуорес;це гтнои реакции микроагглюти1гации разведения сыворагки в опыте и контроле при добавлении диаг- 1о л-икума увеличиваются в 2 раза,

Пример осуществления сг осооа подгоовки сыворотки к ДИаГПСХЛИКС ВОЛЫГ СКОЙ

ихорадки.

Материалы и методы,

1. Сухой /цоминесцируюший диа иисгикум Квинтана для иммунофлюороси.-итиой реакции микроагглютинации - экс1(е)11ментальная серия № 2, приготовленный в лабо ратории яилемических риккез озов Пермского НИИ вакцин и сьшороток, запаяла в ам пулы БЦЖ, содержимое каждой ампулы регидратируется в 0,5 мл дистиллированной воды, 2.Иммунные сыворотки к риккетсиям Квинтана сер. 2,3,7,8, 3.Иммунная сыворотка х риккетсням Провачека сер. J.D4, 4.Иммунная сыворотка к риккетсиям Сибирикус сер. 8. 5.Нормальная сыворотка кролика. 6.Иммунофлюоресцентная реакция микpoaгглютинaдkи (ИФРМА). Результаты испытания. Результаты изучения в ИФРМА иммунных сывороток к риккетсиям Квинтана, Про вачека и Сибирикус, а также нормальной сыворотки кролика.

1:320 1:160 1:160 1:320

И Ф Р М А При изучении иммунных сывороток к рйккетеиям Квинтана при помощи иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации удается выявить специфические антитела в титрах 1:80-1 :320. При проверке специфичности иммунофлюо ресцентной реакции микроагглютинации пр изучении нормальной сыворотки кролика, а также им1иунных сывороток к другим видам риккетсий (Провачека, Сибирикус),олож№ тельных результатов не получено. Одновременно следует отметить, что ИФРМА с лю минесцируюишм диагностикумом Квинтана в методическом отношении очень простая, а результаты реакции получаются демонстративными и легко поддаются учёту. Формула изобретения Способ подготовки сыворотки для диагностики риккетсиозов, включающий взаимодействие сыворотки с ануигеном, отличающийся тем, что, с целью повыщения достоверности диагностики волынской лихорадки, в качестве антигена используют люминесцирующий корпускулярный диагностику м Квинтана. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. В. Г. Затуловский и др. Применение люминесцентно-серологических методов лабораторной диагностики риккетсиозов . Сб, Вопросы иммунологии, Киев, 1965 г., стр. 184-188,