СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНОГО РИККЕТСИАЛЬНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2015 года по МПК A61K39/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике риккетсиозов, и может быть использовано для выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в сыворотке крови людей, а также при изучении иммунологической структуры населения и проверке эффективности вакцинации.

Известен способ получения флуоресцирующих риккетсиальных диагностикумов для иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (П.С. Барбан, В.Я. Мирский. Лаб. дело, 1973, №1. с 28-30; П.С. Барбан, В.Я. Мирский. - Лаб. дело, 1975, №5, с. 315).

Однако при этом способе каждый вид риккетсий и коксиелл был конъюгирован с органическим красителем (изотиоцианатом флуоресцеина - ФИТЦ) и использован в раздельных постановках в иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). Меченые риккетсии и коксиеллы окрашиваются ФИТЦем в зеленый цвет и не могут быть индицированы в едином диагностикуме. Кроме того, технология приготовления таких диагностикумов длительна и энергоемка (18 часов конъюгация и 3-5-кратное высокоскоростное центрифугирование).

Целью изобретения является упрощение способа выявления антител к риккетсиям и коксиеллам в сыворотке крови людей, сокращение постановки реакции в 2 раза и повышение детекции (фотостабильность и высокая яркость) иммунофлуоресцентного анализа.

Сущность способа заключается в получении мультиплексного диагностикума путем соединения риккетсий Провачека и коксиелл Бернета, меченных наночастицами, разными по цвету флуоресценции, и использовании их для одновременного выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в одной постановке иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА).

Для метки риккетсиальных и коксиеллезного антигенов используют полупроводниковые коллоидные наночастицы, обладающие флуоресценцией в разных диапазонах видимого спектра (Воробьев И.А., Рафаловская-Орловская Е.П., Гладких А.А., Поташникова Д.М., Бартенева Н.С. Цитология. 2011, т. 53, №5, с. 392-403; Патент RU 2381304 РФ). Корпускулярный антиген риккетсий Провачека конъюгируют с наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), а корпускулярный антиген коксиелл Бернета - с наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм). Конъюгацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Удаление непрореагировавших наночастиц осуществляют методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Затем меченые риккетсии и коксиеллы соединяют в мультиплексный диагностикум и используют его в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА) для выявления антител одновременно к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета.

Пример 1. Получение меченого антигена риккетсий Провачека.

В качестве исходного материала используют корпускулярный антиген риккетсий Провачека (патент №2062110 РФ). Содержимое ампулы с антигеном ресуспендируют в 0,05 М боратном буфере pH 7,2 до концентрации риккетсий 1×10⁹ степени. К взвеси риккетсий добавляют 10 мкл коллоидного раствора наночастиц с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм) и содержанием частиц 3,0×10^-5 мол/л. Конъюгацию риккетсий и наночастиц проводят при постоянном перемешивании при температуре 6-10°C в течение 1 часа. Непрореагировавшие наночастицы удаляют методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Элюат стандартизуют до 1×10⁹ в 1 мл и контролируют на иммунофлуоресцентную активность и отсутствие спонтанной агглютинации в ИФРНА.

Таблица №1 Исследование иммунных сывороток к риккетсиям и коксиеллам с меченым антигеном риккетсий Провачека в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации № пп Наименование исследуемой сыворотки Количество сывороток Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) Индикация положительного результата 1 Сыворотки к риккетсиям Провачека 10 1:208 4+ агглютинаты красного цвета 2 Сыворотки к коксиеллам Бернета 10 отсутствует Изолированные риккетсии красного цвета 3 Контроль   отсутствует Изолированные риккетсии красного цвета

Результаты исследований приведены в табл. 1, из которой видно, что предложенный меченый антиген Провачека агглютинируется (4+) антителами к риккетсиям Провачека, находящимися в гомологичных сыворотках, не взаимодействует с гетерологичными сыворотками (к коксиеллам Бернета) и располагается изолированно, как и в контроле.

Пример 2. Получение меченого антигена коксиелл Бернета

В качестве исходного материала используют корпускулярный антиген коксиелл Бернета (патент №2167674 РФ). Содержимое ампулы с антигеном ресуспендируют в 0,05 М боратном буфере pH 7,2 до концентрации коксиелл 1×10⁹ степени. К взвеси коксиелл добавляют 10 мкл коллоидного раствора наночастиц с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм) и содержанием частиц 3,0×10^-5 мол/л. Конъюгацию коксиелл и наночастиц проводят при постоянном перемешивании при температуре 6-10°C в течение 1 часа. Удаление непрореагировавших наночастиц проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Элюат стандартизуют до 1×10⁹ коксиелл в 1 мл и контролируют на иммунофлуоресцентную активность и отсутствие спонтанной агглютинации в ИФРНА.

Таблица №2 Исследование иммунных сывороток к риккетсиям и коксиеллам с меченым антигеном коксиелл Бернета в ИФРНА № пп Наименование исследуемой сыворотки Количество сывороток Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) Индикация положительного результата 1 Сыворотки к коксиеллам Бернета 10 1:120 3+ агглютинаты коксиелл зеленого цвета 2 Сыворотки к риккетсиям Провачека 10 отсутствует Изолированные коксиеллы зеленого цвета 3 Контроль   отсутствует Изолированные коксиеллы зеленого цвета

Результаты исследований приведены в табл. 2, из которой видно, что антитела к коксиеллам Бернета, находящиеся в гомологичных сыворотках, вызывают агглютинацию (3+) коксиелл, в то время как в реакции с гетерологичными сыворотками и в контроле коксиеллы располагаются изолированно.

Пример 3. Отстандартизованные антигены, меченые разными цветами, объединяют в соотношении 1:1 и проверяют на иммунофлуоресцентную активность, отсутствие спонтанной агглютинации и специфичность детекции. При получении положительного результата с гомологичными сыворотками (образование 3+ - 4+ агглютинатов), отсутствии спонтанной агглютинации, отсутствии агглютинации с гетерологичными сыворотками, мультиплексный диагностикум используют для диагностики сыпного тифа и коксиллеза.

Таблица №3 Исследование иммунных сывороток к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета с мультиплексным диагностикумом в ИФРНА № пп Наименование исследуемой сыворотки Количество сывороток Иммунофлуоресцентная активность (средний геометрический титр) Индикация положительного результата флуоресценции 1 Сыворотки к риккетсиям Провачека 10 1:160 4+ агглютинаты риккетсий Провачека красного цвета, изолированные коксиеллы Бернета зеленого цвета 2 Сыворотки к коксиеллам Бернета 10 1:69 3+ агглютинаты коксиелл Бернета зеленого цвета, изолированные риккетсии Провачека красного цвета, 3 Контроль   отсутствует Изолированные риккетсии Провачека красного цвета, изолированные коксиеллы Бернета - зеленого цвета

Таким образом, приготовленный мультиплексный диагностикум (табл. 3) обладает достаточной иммунофлуоресцентной активностью с гомологичными сыворотками и не взаимодействует с гетерологичными сыворотками, не дает спонтанной агглютинации в контроле и позволяет четко индифицировать по цвету флуоресценции риккетсии Провачека и коксиеллы Бернета в одной постановке ИФРНА. Возможность использования мультиплексного риккетсиального диагностикума для одновременного определения антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета сокращает время проведения реакции в 2 раза и улучшает детекцию иммунофлуоресцентного анализа за счет фотостабильности и яркости наночастиц.

Изобретение относится к медицине, а именно к диагностике риккетсиозов, и может быть использовано для выявления антител к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в сыворотке крови людей, а также при изучении иммунологической структуры населения и проверке эффективности вакцинации. Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума включает в себя метку корпускулярных антигенов риккетсий и коксиелл полупроводниковыми коллоидными наночастицами разного цвета флуоресценции. Корпускулярные антигены риккетсий Провачека конъюгируют с наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), а корпускулярный антиген коксиелл Бернета - с наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм). Конъюгацию проводят в течение 1 часа при постоянном перемешивании. Удаление непрореагировавших наночастиц проводят методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Затем меченые риккетсии и коксиеллы соединяют в мультиплексный диагностикум и используют его в иммунофлуоресцентной реакции наноагглютинации (ИФРНА). Мультиплексный диагностикум позволяет выявлять антитела одновременно к риккетсиям Провачека и коксиеллам Бернета в одной постановке ИФРНА. Способ упрощает выявление специфических антител в сыворотке крови людей, сокращает время проведения реакции в 2 раза и повышает специфичность детекции иммунофлуоресцентного анализа. 3 табл., 3 пр.

Способ получения мультиплексного риккетсиального диагностикума, включающий метку корпускулярных антигенов риккетсий Провачека в концентрации 1×10⁹ наночастицами с длиной волны флуоресценции в красном диапазоне спектра (610-670 нм), коксиелл Бернета в концентрации 1×10⁹ - наночастицами с длиной волны флуоресценции в зеленом диапазоне спектра (520-540 нм), конъюгацию в течение 1 часа, удаление непрореагировавших реагентов методом гель-фильтрации на сефадексе G-25, соединение активных меченых антигенов в мультиплексный диагностикум в соотношении 1:1.