Способ получения динуклеотидов Советский патент 1988 года по МПК C07H21/00 

Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей формулы

НОСИ,

где R - остаток азотистого основания нуклеиновой.кислоты: цитозин, урацил, аденин, гуанин, которые используют как исходные вещества при синтезе более высокомолекулярных олигонуклеотидов и нуклеиновых кислот в исследовательских целях и как лекарственные препараты в медицине .

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта,

Пример 1. 4,55 г (12 мкмоль) С р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль 1 М водного раствора этилендиамина (рН 7,8), Лйофилизуют в вакууме пр 10 мм рт.ст., нагревают до 40 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемешивание), лиофилизации, нагревании до 40 С и выдерживания пр этой температуре в течение 1 ч повторяют 4 раза. Для вьщеления целевог продукта в реакционную массу добавляют 0,05 Мл воды и переносят раство на хро-матографическую бумагу ватман 3 мм, осуществляют нисходящее хрома- тографирование в системе А: изопро- панол-аммиак-вода (7:1:2 по объему). Полосы с определенным R(А), соответствующие полученным веществам, вырезают, R(А) - адсорбционная подвижность продуктов реакции относительно Ср в хроматографической системе А. Полученные вещества с хроматографи- -ческой бумаги элюируют смесью спирт вода (7:3 по объему). Растворитель отгоняют в вакууме и получают Gp Ср в чистом виде. Структуру полученного целевого продукта доказывают фер0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

, , . ОТН. Ср

280 нм.

ментативным гидролизом с панкреатической рибонуклеазой по известному методу, а также данными спектрофото- ме трического анализа.

Выход Ср Ср при четырех одночасовых циклах составляет 13,0%. При таком же суммарном времени выдерживания в нециклическом режиме по известному способу выход 5,7%, R4.(A), 0,41; УФ-спектр: 240 нм.

Пример 2. 4,55 мг (12 мкмоль) V р растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль)

1М водного раствора этилендиамина (рН 7,8). Лйофилизуют в вакууме при 10 мм рт.ст., нагревают до и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 2 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл ВОДЬ и перемешивание), лиофилизации, нагревания и выдерживания в течение

2ч повторяют 3 раза. Целевой продукт VpVp выделяют аналогично примеру 1. Выход VpVp при трех,- двухчасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени выдерживания реакционной смеси 6 ч составляет 14,47% (0,39 мг). При этом же времени выдерживания в нециклическом режиме выход 4,8%,.Rt(A)o, 0,43; УФ-спектр:

/ MoiKo 262 нм, ,„ 230 нм.

Пример 3. 4,85мг (12 мкмоль) растворяют в 0,05 мл (50 мкмоль) 1 М водного раствора этилендиамина (рН 7,8), Лйофилизуют в вакууме при 10 мм рт.ст., нагревают до 50°С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч. Затем цикл растворения (добавление 0,05 мл воды и перемещивание), лиофилизации, нагревания и вьщерживания в течение

1ч повторяют 2 раза. Целевой продукт Ар Ар выделяют аналогично примеру 1. Выход Ар Ар при двух одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном времени вьщерживания

2ч составляет 8,29% (0,24 мг). При этом же времени вьщерживания в нециклическом режиме выход - 5,15%. |СА)отн.Ар 0. ; УФ-спектр: 257 нм, Х 230 нм.

Пример 4. 4,55мг (14 мкмоль) I 3 растворяют в 0,2 мл (200 мкмоль) 1 М водного раствора этилендиамина (рН 7,8), Лйофилизуют в вакууме при

- 2 О

10 мм рт.ст., нагревают до 50 С и выдерживают при этой температуре реакционную массу в течение 1 ч.

Затем цикл растворения, (добавление 0,05 мл воды и перемешивание) лиофи лизации, нагревания и выдерживания в течение 1 ч повторяют 3 раза. Выход IP IP при трех одночасовых циклах и, соответственно, при суммарном выдерживании 3 ч составляет 5,83% (0,15 мг). При этом же времен вьздерживания в нециклическом режиме выход 4,09%. R(A)O,H.QP 0,38; УФ- спектр: „ 256 нмД,,„н 228 нм. Структуру полученных динуклеотидов Ар Ар и IP IP доказьшают известным ферментативным гидролизом с рибонук леазой Р brevicompactum.

Как следует из приведенных примеров, предлагаемый способ позволяе в 2-3 раза повысить выход целевого продукта.Формула изобретен ч

1. Способ получения динуклеотидо общей формулы

Носи,

/OvR

О он о

-CHj

о он

н

где R - остаток азотистого основания нуклеиновой кислоты, выбранный из цитоэина, урацила, аденина, гуанина, путем твердофазного, катализируемого этилёндиамином синтеза, вклю- чаюЕ(его растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего иуклеозид-2 ,3 -циклофосфата, лио0 филизацию этого раствора, инкубацию нагретой сухой реакционной массы и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения, выхода целевого про5 дукта, проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и подвергают . повторной лиофилизации и инкубации.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что инкубацию сухой р еакционной массы проводят при 40- 70°С в течение 1-2 ч. .,

5 3. Способ по п. 1, отличающий с я тем, что растворение в воде, лиофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы повторя- . ют 2 - 6 раз.

0

Изобретение относится к способу получения динуклеотидов общей формулы носв O.R О ОЯ А-сн, о он 0-Р-ОН «« где R - остаток азотистого основания нуклеиновой кислоты; цитозин, урацил, аденин, гуанин. С целью повышения выхода целевого продукта осуществляют твердофазный, катализируемый этилендиамином синтез, включающий растворение в водном растворе этилендиамина соответствующего нук- леозид-2 ,3 -циклофосфата, лиофили- зацию зтого раствора, инкубацию нагретой до 40-70°С массы в течение 1- 2ч. Проинкубированную реакционную массу растворяют в воде и повторяют диофилизацию и инкубацию нагретой сухой реакционной массы в 2,6 раз. После зтого выделяют продукт. 2 з.п. ф-лы. I Nj; сд ю