Нитрофурилполиенхинолинаспарагиназы,обла-дАющиЕ пРОТиВОлЕйКОзНОй АКТиВНОСТью Советский патент 1981 года по МПК C12N9/82 A61K31/4709 A61K38/50 A61P35/02 C07D215/50 C07D307/70 C07K17/02 

Изобретение относился к новым сое динениям нитрофурилполиенхинолинаспарагиназам, которые могут найти применение в медицине в качестве противолейкозных и антибактериальных препаратов.Известно применение L-аспарагиназ в качестве противолейкозных средств Ц В качестве медицинской формы пролонгированного действия известны также химически модифицированные L-аспарагиназы: например гциласпарагиназы 2J , з , амидоаспараги ,азоаспарагиназы назы 4. Однако ни одна их этих модификаци не повышает противолейкоэного эффекта Ь-аспарагиназы и не изменяет спек ра, ее действия. Цель изобретения - повышение противолейкозной активности L-аспарагина зы, создание противоопухолевых препаратов нового структурного типа и расширение средств воздействия на живой организм. Это достигается нитрофурилполиенхинолинаспарагиназами общей формулы 1гаспарагиназсГ JPL ()n где R - Н, Clf Alk, OAlkj . n 1-3. Способ получения указанных выше соединений основан на известных методах ацилирования L-аспарагиназы ангидридами и хлорангидридами кислот 5. Приведенные примеры поясняют ацилирование L-аспарагиназы производными нитрофурилполиенхинолин -4-карбоновых кислот. Пример 1.Кбмл полунасыщенного раствора Na-ацетата, содержащего 11280 м.е. L-аспарагиназы 13,2х М Ь-аспарагиназы; конц. белка 11,2 мг/мл уд. активность 168 м.е мг белка), добавляют 78 мг (2,.М) хлорангидрида (5-нитрофурил-2)-винил -хинолин-4-карбоновой кислоты. Гетерогенную смесь перемешива;ют 2 ч на ледяной бане. Центрифугируют 10 мин при 6000 хд. Надосадочную жидкость диализируют против 300 объема 0,05 М фосфатного буфера содержащего 0,002 М L-аспарагиновой кислоты, затем- против 0,002 М раствора L-аспарагиновой кислоты. Диали зат содержит 11230 м.е. L-аспарагиназной активности. К-нек/ добавляют 67 мг маннитола и лиофилизируют. Препарат содержит 45,5 Ме,е,/мг сух го веса или 164 м.е./мг белка Lаспарагиназной активности, имеет изоэлектрическую точку рЗ 4,70, Ст пень ацилирозания 26% NHj-rpynn. Препарат увеличивает продолжительно жизни мышей н-а 15%„ Пример 2, Проводят как опи сано Е примере 1.-, К 7 мл раствора Ь-аспарагиназы (17760 м.е. фермента или 1,9-10 М конц, белка 11,3 мг/мл; уд., акт, 158 м«е/мг белка) добавляют 57 мг (1, 85-Ю М) гидрида (5 нитрофурил-2)-1,3-бутадиенил -хино лин-4-карбоновой кислоты. Лиофилизи рованный препарат ациласпарагиназы содержит. 127 м.е. /мг белка или б4м,е./мг сухого веса, имеет рЗ 4,7 оптимум рН 7,0. Степень ацилировани 23% NRj -групп. Препарат повышает выживаемость мышей-опухоленосителей на 56% относительно нативного ферме та, -Пример 3. Проводят идентич но примеру 1, но в качестве ацилиру щегр агента добавляли 57 мг (1, М) хлорангидрида 7-хлор-2 2-{5-нитрофурил-2)винил -хинолин-4карбоновой кислоты. Лиофилизирова ный препарат содержит 207 м.е./мг . .белка или 93 м.е./мг сухого веса; имеет рЗ 5,33, оптимум рН 6,0. Сте пень ацилирования 84% NHri -групп. Пре парат повьшает выживаемость мьшей на 32%. Пример 4. Проводят идентичн примеру 1 с использованием в качестве ацилирующего агента 57 мг (1,80 X 10 М) хлорангидрида 7 хлор-2- 4--(5-нитрофурил 2)-1,3-бутадиенил - хинолин 4-карбоновой кислоты, Лиофилизированный препарат содержит 119 м,е,/мг белка или 71 м.е./мг сухого веса имеет рЗ 5,30f оптимум рН 7,5. Степень ацилирования 11,5% ЫНл-групп. Препарат повышает выживаемость мышей на 38%. Пример 5. Проводят в условиях, описанных в примере 1, с использованием - в качестве адилирующего агента 23,7 мг (70 мкм). хлорангидрид 7 ieтoкcи-2- 2- (5-нитрофурил-2 ) -зинил-4-карбоновой кислоты на 1 1,52 мкм 7-аспарагиназы (184-м.е./мг белка/конц. белка 16,2 мг/мл). . Препарат после анализа стабилизируют добавлением 1 мг глидина/мг белка. Препарат содержит 179 м.е./мг белка, имеет рО 5,35, степень ацилирования 7,5% NHj,-групп. Препарат продлевает вьшдаваемость лейкозных .мышей на 20%. Пример 6. Проводят в условиях, описанных в примере с использованием в качестве ацилирующего агента 19 мг (10 мкм) хлорангидрида 2-(2-15-нитрофурил-2)-винил-7,8-диметилхинолин 4-карбоновой кислоты, на1,03 мкм L-аспарагиназы (160мае,/мг белка, конц., белка 7,2 мг/мл).. Препарат содержит 79 м.е./мг белка, р G 4,83, степень адилирования 22% NHj-групп. , Пример .7. Проводят согласно методике, описанной в примере 1, с использованием в качестве ацилирующего агента 70 мкм хлоранг.идрида (б-нитрофурил-2) 1,3,5-гексадиенил -хяналин-4-карбоновой кисло тъ на 1,52 мкм L-аспарагиназы, Полученный препарат содержит 97 м.е./мг белка; рЗ 5,20, степень ацилирования 16% ЫН,-групп, Противолейкозное действие нитрофурилполиенхинолинаспарагиназ изучено экспериментально на перевиваемую мышиную лейкемию L - 5178. В некоторых случаях использован резистентный к L-аспарагиназе подшта /м лимфоидной лейкемии L - 5178 и асяитная опухоль Эрлиха. Как лимфоидная лейкемия L -- 5178, так и асцитная опухоль Эрлиха прививались внутрибрюшинно в количестве 10 клеток на мышь. Лечение подопытных мышей начато на 3-й день после прививки в случае лимфоидной лейкемии L - 5178 на 1-й день у мышей с асцитом Эрлиха. Фермент растворялся в физиологическом растворе хлористого натрия ех tempera и вводился внутрибрюшинно один раз в день ежедневно. 5 дней подряд. Опыты с лимфоидной лейкемией L - 5178 произведены на мышах линий ДВА и BALE, а с асцитной опухолью Эрлиха на беспородных белых мышах. Вес мы1ией 18-20 г. Количество мышей в подопытной группе б, в контрольной 20. Все исследования произведены в сравнении с нативной L- аспарагиназой, .из которой получены модификации. Действие хлорангидридов (5-нитрофурил-2) 1, 3, 5-гексатриенил -хинолин-4-карбоновой и (6-нитрофурил-2)-винил-7,8-диметилпиколин -4-карбоновой кислот (примеры 7 и б) изучено на лимфоидной лейкемии L - 5178, который по своей генетической природе несколько отличается от штамма L - 5178, Опыты произведены на гибридах -первого поколения мышей линии ДВА и Cgr ВС. Во всех случаях критерием эффекта с-пужила продoлжнтeJIьность жизни подопытных мышей. Продление жизни иыражено в процентах по сравнению с длительностью жизни контрольных (нелеченых)

мдцей. полученные данные отображены в таблице.

Продолжение таблицы

L-аспарагиназы амид (5-нитрофурил-2)-винил -7-хлорхинолин-4-карбоновой кислоты

L-аспарагиназа

Ь-аспа рагиназы амид (5-нитрофурил- 2.)-1,3-бутадиенил -7-хлорхинолин-4-кар6оновой кисЛС5ТЫФормула изобретения Нитрофурилполиенхинолинаспара зы общей формулы -П (CH(;H) ,

+32

1500

L 5178

(f

+38

1500

L 5178 где R - Н, С1, Alk, OAlk; 55 n 1,3, обладающие противолейкозной актив.ностью. Источники информации, gQ принятые во внимание при экспертизе 1.9,C.WrlSton, The Enzymes (ed. by Boyer R,D.). Acod Press, N-Y, . 1971, p. ipl. , H.Makino, H.Saton, 5.Киго1пэ,. 5 Sh. Jamarani, Jn. Taraaura,ln. Jnada, I mmunochem i cal properties of asfara-1 glnase Modified by chemical substl- tutions, Immunochemistry, 12, 183, 1975. 2. Патент ФРГ 1803782, кл. 6 а 22/10, 1968. 3. Патент Франции 2081382, кл, A 61 к 19/00, 1970. 4. Патент ФРГ № 2039061, кл. 6 a 22/10, 1971. 5. Патент ФРГ 1807303 кЛ. 6 а 22/10, 1968.