Способ определения мальтазной активности ферментов Советский патент 1977 года по МПК C12D13/10 

1

Изобретение отноеится к области микробиологии, а именно к способам определения мальтазной активности ферментов.

Известны способы определения мальтазной активности ферментов путем приготовления инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор, причем в качестве обоих субстратов используется мальтоза 1. Мальтазную активность в этих способах определяют по скорости ферментативного гидролиза мальтозы. Из известных способов определения мальтазной активности ферментов наиболее близким изобретению по технической суш.ности и достигаемому результату является способ, предусматривающий приготовление инкубационной смеси, включающей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор- глицерин 2. Однако данный способ является неточным, так как присутствующие в препарате трансглюкозилазы способны образовывать продукты трансглюкозилирования, которые существующий метод не учитывает.

Целью изобретения является повыщение точности определения за счет контроля трансглюкозилазной активности, являющейся частью мальтазной. Для достижения поставленной цели в способе, предусматривающем приготовление инкубационной смеси, включаюн1,ей ферментный препарат, субстрат-донор и субстрат-акцептор - глицерин, составляют дополнительную инкубационную смесь без субстрата-акцептора, сравнивают выход

глюкозы в обеих смесях и по разности судят о трансглюкозилазной активности.

В качестве субстрата-донора можно использовать паранитрофенилглюкозид или мальтозу.

Способ использования паранитрофенилглюкозида заключается в след Ю1цем.

Составляют две инкубационные смссн, одна из которых является опытной и содержит ферментный препарат, 0,5% наранитрофенилглюкозида (ПНФГ), ацетатный буфер с рН 4,7 и 10% глицерина, другая смесь является контрольной и содержит все те же компоненты, за исключением глицерина.

Степень трансглюкозилировання определяется по формуле

пнф.к

1ЛЕпнф.опДЕу,,;

где ДЕпнф, к н ДЕпнф, оп - изменения оптической плотности окрашенных растворов наранитрофенола (ПНФ)-продукта превращения паранитрофенилглюкозида в контроле н в опыте соответственно.

3

АЕу, on и АЕу, к - изменение оптической плотности ироб с глюкозооксидазным реактивом в контроле и в оныте.

Мальтазная активность (МА), нриходящаяся на единицу препарата, вычисляется по формуле

Vv

МА

0,18.й

где УК - выход глюкозы в мг на 1 мл ко 1трольной инкубационной смеси; t - время инкубации; Ь - концентрация фермента, г/мл. Способ использования мальтозы заключается в следующем.

Составляют две инкубационные смеси, одна из которых является опытной и содержит ферментный препарат, 0,05% мальтозы, 0,1 н. ацетатный буфер рН 4,7 и 10% гли церина. Другая смесь является контрольной и содержит те же компоненты, за исключением глицерина.

АцетатныйРаствор

ПНФГ 0,25% буферпрепарата

1 н. рН 4,7фермепта

Контроль 2 I6

Опыт

Степень трансглюкозилировамия Т определяют графически.

По значениям выхода глюкозы в контроле УК находят величину мальтазной активности

,

2г .0,18.6

где УК - прирост глюкозы в контроле за время инкубации, определяемый при помощи калибровочного графика; 2 - коэффициент; / - время инкубации; 6 - концентрация фермента в инкубационной смеси, г/мл,

0,18 - коэффициент перевода из мг в мкмоль.

Пример 1. Система: 0,05% паранитрофе20 нилглюкозида (ПНФГ) -10% глицерина.

Составляли инкубационные смеси из следующих компонентов (мл).

Глицерин ВодаИтого

0110

1О10

Использовали препарат, полученный из глубинной культуры гриба Endomycopsis species 20-9. Порошок растворяли в дистиллированной воде в концентрации 1 мг/мл. Инкубацию вели в ультратермостате при 30°С.

После указанных в табл. I сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси пробы около 3 мл и нагревали в кипящей водяной бане 5 мин. В табл. 1 приведены онтические плотности, соответствующие выходу паранитрофенола и глюкозы в системе ПНФГ - глицерин под действием ферментов.

Таблица 1

Для определения оптических плотностей свободного паранитрофенола к 0,5 мл пробы приливали 3,3 мл дистиллированной воды и

Ацетатный Ма.пьтоза 1%буфер

I н. рН 4,7

Контроль 0,5,0

Опыт

0,5

1,0

0,2 мл 5%-ной соды. Оптическую плотность окраски измеряли на ФЭКМ при синем светофильтре при длине волны 400-450 нм.

Выход глюкозы определяли с глюкозооксидазным реактивом по модифицированному методу Далквиста. На анализ брали по 0,5 мл инкубационной смеси. В результате

получили данные, приведенные в табл. 1. Значения степени трансглюкозилирования Т вычислили по формуле

АЕ,

ДЕ.

У,оп

пнф,к

1ДЕ

ДЕ

У. к

пнф.оп

где АЕпиф.к и ЛЕпнф.оп -прирост экстинций ПНФ за время инкубации в контроле и в опыте соответственно, АЕу, оп и АЕу, к - прирост экстинций проб с глюкозооксидазным реактивом за время инкубации t в опыте и в контроле соответственно. Например, для мин

Т - 1 - О-117-0,054 0,080-0,031 Q 24 0,092-0,0520,141-0,040

Пример 2. Система: 0,05% мальтозы - 10% глицерина.

Составляли инкубационные смеси из слелЧующих компонентов (мл).

Итого

10

10

Инкубацию вели в ультратермостате при 30°С. После указанных в табл. 2 сроков инкубации отбирали из инкубационной смеси

В пробах определяли выход глюкозы (оптическую плотность) с глюкозооксидазным реактивом. Полученные данные представлены в табл. 2. Значения степени трансглюкозилирования (Т) определяют графически. Значения, полученные в системах ПНФГ - глицерин и мальтоза - глицерин, близки.

Мальтазную активность рассчитывали по формуле

МА 2,1 10-3 мг.мл-1

-1

мин 30.2

в международных единицах

МА 2, МО-МО 290ед/г,

0,18.10-.0,4

0.4-10-3

.концентрация препарата, г/мл

где 10

инкубационной смеси.

Способ прост, быстро дает надежную характеристику препаратов. Использование предлагаемой характеристики мальтазной активности с указанием стецени трансглюкозилирования дает возможность правильно оценивать эффективность и направление амилолититического препарата на различных этапах превращения крахмалистого сырья.

пробы около 2 мл и нагревали в кипящей бане 5 мин.

Таблица 2

Формула изобрете:ния

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

2.Sugawara S. Gournal Faculty of Acticulture Hokkeido University 52, 257, 1962.