(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ
Для обозначения аминокислот, пептидов, активирующих и защитных группировок и реагентов, используемых для активации и зашиты аминокислот и пептидов, пртиеняются следующие сокращения:
d - АЬи -аминомаспяная кислота;
ji - Abu - I -аминомасляная кислота;
- Асар- j -аминокапроновая кислота; А а аланин; f - -аланин; гинин; О AvqE -аминовалериановая кислота; d. , Dab - « . у -диаминомасляная кислота; -глицин (глшсокол); А6 -гистидин; Leo -лейцин; Lys -лиаин; NEeчнорлейцин; Pile -фенилаланин; -про- лин; Sar-саркозин; Sef -серин; Thh -треонин; Тзг -тирозин; Уаб -валин:; Аос трет- амилоксикарбонильная группа; Bt6 -бенаиловый эфир; Вос: N, Н-дициклогексилкapбoдIJйl ид; НО MB - Н -окси-3- ор6орнен-2,3-дикарбоксимйд; OBzB -сложный бен- зиловый эфир; ODNP -2,4-дит1трофениловый эфир; OEt -этиловый эфир; ON В -эфтф на основе оксн-5-карборнен-2,3 дш{арбоксимида; ирср -пентахлорфениловый эф1ф; Оси- N -аксй:сукциш мидный эфир; OtBu -трет бутиловый эфир; То5 -тозильная группа; 2 бензилокс1гкарбонильная группа; ВОС -трет бутилоксккарбонилъная группа.
Когда R, представляет атом водорода, группировка. R - обозначает следующую аргинильную группу
f
{сн.).-сн-со
23 ,
NH2
Термин аминокислотный остаток подразумевает группировку, способную образовывать пептидную связь, например группу представляющую собой аминокислоту, лишеннуюодного шт обоих атомов водорода от аминогруппы (иди аминогруппы в случае иминокарбоновых кислот) и от гидроксила карбоксильной группы.
Основные или нейтральные аминокислоты обозначенные R , содержат в предпочтительном варианте 2-10 атомов углерода. В качестве npmvtepa основных аминокислот, использованных для получения предлагаемых полипептидов, можно привести такие аминокислоты, как ot , |i -диаминопропионовая кислота, оС , fi -дкаминомасляная кислота, аргинин, лизин и гистпдин. В качестве примера нейтральных аминокислот, подразумеваемь х под R , можно указать такие аминокислоты, как глицин, аяанин, серан, треонин, ct -амниэмасликую кислоту, пролин, лейцин, изолейцнн, нэрлейнин, ф ;нилал«нин и тирозин, а также л{).угие амннокислоть, такие, как -аланин, 7f «миноМасляная кислота, 8 - аминовалериановая кислота и g - аминокапроновая кислота. Для тех аминокислот, которые могут существовать в виде оптических изомеров, RJ обозначает любой из оптических изомеров соответствующих аминокислот или рацемические соединения. Среди аминокислот, соответствующих R , fl -аланин является особенно предпочтительным для целевого использования.
Нейтральные аминокислоты, представленные R , содержат предпочтительно 2-10 атомов углерода. Примером таких
аминокислот является глицин, аланин, р - -аланин, саркозин, серин, цропин, валин, лейНИИ,изолейцин, фенилаланин и тирозин. Среди аминокислот, соответствующих Rj, глицин и пролин являются наиболее предпочтительньгми для использования но указанному назначению. В случае, когда R- представляет остаток пролина, целевое применение достигается даже в том случае, когда R, представляет собой атом водорода.
Аминокислоты, которые могут входить
в состав тирозильных пептидов или их амидов, содержат предпочтительно 2-10 атомов углерода каждая. Примерами таких аминокислот являются глицин, аланин, серин,
треонин, валин, пролин, лейцин, изолейцин, лизин, фенилаланин и тирозин. Эти аминокислоты связываются в любой последовательности с образованием тирозильных пептидов или их амидов, содержащих в своем
составе от 1 до 5 аминокислотных остатков. Такими тирозильными пептидами и их соответствующими амидами, которые иногда называются амидами тирозильных пептидов являются, например, следующие соединения:
Т)г-ЬЕм-ОН;
Ьг AEd-GEvj-OH,
Т:(Г Leu -AEa-G v-OH;
Leu- uE -Vae-AEa-OHj
Tvr- Thr-Pro -Leu-Phe-ОИ, Tvr-Thr- ro-Lvs - деа-ОН;
Tvr-Thr-Pro-Ls6 - Thr-OH;
Tvr -Ser -Pro-Arg-- Qev- OH;
T-jr -Pro- лее - OH)
Tvf - Leu -Leo- Leu-OHj
- G,e)-c,ev-G,ev-Gev-oH;
- Aea-Aea-Aea-Aeoi-oH;
Tvr -ThrPro- LV5 -,OH.
Среди аминокислот, тирозильных пептидов и их амидов ТУг NH является наиболее предпочтительным для целевого назначения (для получения предлагаемьсх гюлипептидов), в том числе и для промышленного производства пэлипептидов.
В том числе, когда аминокислот,, представленные R или входящие в состав i руппы R , могут сутцрютвовать в виде оптических изомеров, эти аминокислоты могут иметь любую оптическую конфигурацию (мо гут быть любым оптическим изомером) или тредставлять собой рацемическое соединени Реакцию конденсации можно проводить, используя приемы и методы конденсации, известные для образования пептидной свйзи Перед проведением реакции кондеясашш можно защитить карбоксильные и аминные группы, которые не должны принимать учас тия в рассматриваемой реакции, или, наобо рот, активировать карбоксильную и/или ами ную группы, которые должны участвовгть в этой реакции. Все операции по защите или активации функциональных групгг реагирующих веществ осуществляются известныкти методами. Карбокисльные группы в исходных веществах, которые не должны вовлекаться в реакцию конденсации, могут быть защищены сопеобразованием, т.е. переводом в соответствующие металлические сояи (например, натровые или калиевые соли) или этерифтпсацией, что связано с получением соответствующих сложных эфироз (например, метилового, этилового, бензилового. -нитробензилового, трёт.-бутилового или трет .-амилового). В качестве защитных группировок для аминогрупп исходных соединений могут быт использованы любые известные защитные группировки, которые гфимешпотся в пептидном синтезе, например бензилоксика| онипьная, трет.-ЙуганоЁСЕасарбонильная, трет -амилоксикарбоЩяьная, иэоборнилоксикарбо1шльная и другие группы. Эти защитные грушгаровка могут йcпoJiьзoвaтъcя щиты аминогруппы Пронина. Имидазольная функция гистидина может быть защшцена с помощью любой применяемой для этой цепи защитной группы, наприм бензильной, тозильной, 2,4-динитрофенольной, трет.-бу- тилоксикарбонильной ипи бензилоксикарбонильной. Гидроксчльные группы серина, тре онина и тирозина могут быть защ1пцены лю бой обычно применяемой для этой цели защитной Г1 уппой, например бензильной, трет -бутипьной или другой группой, способной образовьтать простой эфир. Гуанидиновая группа аргинина может быть защшцена та- кими группами, как нитрогруппа, тозильная бензилоксикарбонильная, изоборнклоксикарбонильная или адамантилоксикарбонильная, В качестве примеров активированных карбо сильных групп в исходных соединениях мож но назвать соответствующие ангидриды, азиды, активированные эфиры (например, пентахлорфенилэвый, 2,4,5-трнхлэрфениловый, 2,4-динитрофениловый, ин.-.лметиловый h -т1тро)е 1иловый, N -оксисусиинимидный N -окри--5-норборнеи- 2,3-Дйкарбоксимидный, 1 ьксифтатгимндный клй N -оксибензотриазйльный). Реакцию конденсашш мэжно гт|аоводи-ть в присутствии растворителей, ипфоко ис пользуемых в пептидном беавод-. ный или водный дШЛетилфор,, диметяя- сульфоксид, пиридин, хлороформ, диоксая, метиленхлорид (дихлорметан), тетрагидро- фуран, а также различные смеси этих растворител|эй. Температуру для проведения реакции коаденсадии выбирают в пределах днапазояа, относительно которого к.звестно, что он является приемлемым для проведения реакций, приводящих к образованяго пептидных связей. После проведения реакции конденсапии в том случае, когда полученный продукт содержит защитнь е грушнфовки, их алякхг обычными методами, прии епяемьшси для этих целей, Hanpro.iep, катапитнческим воо становлением в присутствии соответствующего катализатора, такого, как палйадиевая чернь, палладий на угле, платина и т.д.; сольволизом с исполызоваЕшем фтористого водорода, трифторуксусной кислоты и так далее, а также восстановлением металлическим натрием в жидком а льшаке. Прим ер 1. Получение Arg-thro - „ phe - РЬе - Туг . Получение Z Аг§ (NO) -РгО {эке--Phe -Туг - NHslO, г t-Phe - РНе-Туг ЫНв растворяют в 5О мл д1{метилформамида1ДМФ) и восстанавливают над ггалладиевой чернью. Через 1О ч катализатор отфнльтровывают, фильтрат охлаждают в ледяной бане и к охлажденному раствору прибавляют 7,37 г Н-ArgCHOg)-Pro-ОН и 3,53 г HON В (N -окси-5 НОрборнен-2,3-дикарбоксамида), туда же прибавлязот 4,06 г дишослогексилкарбодшолида (ДЦГКДИ), и реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч. Образовавшуюся днциклогексилмочввину (ДЦГМ) отфильтровывают, фильтрат упаривают при пониженном давлении. К остатку прибавляют 2ОО мл этнлацетата и полученное при этом твердое порошкообразное вещество отделяют фильтрованием. Осадок чистят перекристаллизацией из смеси ДМФ /метанол/вода. Выход 14,5 г (95,6% от теоретического); т.пл. 100« -103°С; 29,7°,(с О,55%, ДМФ). Найдено, %: С 59,51; Н 6,06; N14,90. C4b f40ioN.e 0 Вычислено, %: С 5-9,73; Н,1О; , N15,11 Б. Получение АР| -Pro -Phe - Phe- -Туг -NHa, loo мг E ) -Pro -Phe - -phe -Тут-NHe растворяют в 30 мл уксусной кислоты, восстанавливают над пал ладяевой чернью, используемой в качестве катализатора гидрирования, в течение 2О ч Катализатор от(|я1пьтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении Полученный остаток растворяют в 50 мл воды, фильтруют, фильтрат сушат лиофнлнзацяей. Лнофилизованный продукт растворяю в б мл воды и раствор вносят в колонну (1,6 X 9 см), запопненнуто карбоксиметилсефадексом, проводят градиентную алюпню 0,1 М водным раствором ацетата аммония (40О мл) и 1 М водным раствором ацетата аммония {4ОО мл). Фракции от 250 по 370 мл, объединяют и диофилизуют. Получают 25О мг (52,3% от теоретического) белого пушистого продукта; ctj i -41,9° (с 0,47%, вода). Аминокислотный анализ продукта (гидролиз проводят соляной кислотой в стандартных условиях): Ar liOO; 1,О5 Tsf 0,91; Phe 1,96 (содержание пептид в продукте 86,5%). Найдено, %: С 56,76; Н 6,98; Nl4,2 .0б1 9Вынислено, %: С 57,06; Н 6,96 N 14,26 П р и М е р 2. Получение Qfy ргч - рКе-Phe--Туг -NHg. А. Получение 2 - - kr% - Pro - -Phe-Phe-Tyr NHg. 80мг (N02)--Pro--Phe - - Phe-TyrNH,растворяют в SO м уксусной кислоты и гидрируют над паллади евой чернью в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворшот в 20 мл воды и лиофилизуют. Полученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 10 мл ДМФ, к раствору прибавляют 147 мг моногидра та Л -толуолсульфокислоты. К полученной смеси прибавляют 349 мг реакционную систему перемешивают в те чёние 1О ч. ДМФ отгоняют при пониженно давлении, к остатку прибавляют 5О мл этиладетата. Полученное при этом порошк образное вещество отделяют фильтрованием Выход продукта 858 мг (89,5% от теоре тического); т.пл. 119-1210С; , (с 0,96%: ДМФ). Найдено, %: С 59,45; Н 6,О8;К12,3 5 2,76 Ae feOQ o HgO.S Н,0 Вычислено, %; С 59,55; Н 6,18, N12,63 §2,89 Б. Получение Cty-А.- -Pro-Phe - -Phe-Tyr -NHa 5OO мг Z -Gfy-Apg-Pro-Phe - -Pbe -NHg n -толуоле ульфоната растворяют в 30 мл уксусной кислоты, восстанавливают над палладиевой чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 20 мл воды, и полученный раствор подвергают ионообменной хроматографии на колонке с Амберлитом 3RA -410 в ацетатной форме ( Af berEite ЗКА -41О представляет собой сильно основную анио- нообменную смолу). Элюат лиофилизгфуют и полученное в результате порошкообразное вещество растворяют в 5 мл воды. Этот раствор наносят иа колонку (2,6 х 23 см) с карбоксиметилцеллюлозной, Элюцию осуществляют градиентньм методом с использованием двух воднья растворов ацетата аммония: О,ОО5 и О,2 М (по 7ОО мл каждого полученного в примере А раствора) с нарастанием концентрации элюента. Фракции в диапазоне от 840 до 97О мл объединяют и лиофилизируют, В результате получают 27О мг (63,6% от теоретического) целевого продукта; с.,. -62,0° (с 0,46%, вода). Найдено, %: С 55,99;Н 6,92; N14,77 ..о Вычислено, %: С 56,15; Н 6,82; N14,89 Аминокислотный анализ: Afg0,94; 1,06; СгВ 1,00; 0,94; he 2.ОЗ (содержание пептида 83,2%). П р и М е р 3. Получение - -Arg-Pro-Phe-Phe-Туг -NHg. Процедуру, описанную в примере 2, повторяют с той только разницей, что BNiecTO Z-GCv-ONB используют Z-у-A-bu-ONB. В результате получают 324 мг указанного соединения; d -58,7° (с 0,45%;вода). Найдено, %: С 56,14; Н 7,36 N13.92 С42МубОт 10-2С2Н О,-ЗН,0 Вычислено, %:С 55,97; Н 7,15; N14,19 Аминокислотный анализ: Afgl,OO; PfO 1,О8; ТУГ- 0,97; Phe 2,13 (содержание пептида 80,8%). П р и М е р 4. Получение 8-Ас«р - - Apg-Pro-Phe-Phe-Tyr-NHj, A. Получение 2 - -Acap-Arg PPO -Phe -Phe -Туг-NHg. В 10 мл ДМФ растворяют 25О мг Z - 6 -Асар-ОН и к полученному раствору
9
при охлаждении на ледяной бане прибавляю 186 мг HONB и 214 мг ДЦГКДИ.
Смесь перемешивают в течение 16 ч, образовавшуюся ДЦГМ от мльтровьшают. Фильтрат прибавляют к диметитгформамвдному раствору Н-Ai g-Pro-Phe - - РКе -Tyi -NHg и - олуолсульфоната который получен по методике, описанной в примере 2А, Смесь перемешивают в течение 12 ч, ДМФ отгоняют при пониженном давлении. К остатку прибавл$пот ЗО мл этилаиетата и образовавшееся при этом порошкообразное вещество отфильтровывают. Выход продукта 810 мг (79,1% от теоретического); тлл. 90-92 4 ; «А.
Т) -30,3 (с 1,07%: ДМФ). N11,8
Найдено, %: С 59,81; Н 6,75; S 3,ОО
,
Вычислено, %: С 59,88-Н 6,65; А/11,84; S 2,80
Б. Получение в- Асар - А г - Pro
-Phe -Phe-Tvr -NHg5OO мг Z -производного, полученного в примере А, обрабатьтают по примеру 2Б в результате чего получают 316 мг указаннргосоединения, -58,9°С { с 0,55%, вода).
Аминокислотный анализ: Ahg ,02; Pro 1,ОЗ; Тчг О,92; he 2,13; Е -Асар не определяли; (сод эжание пептиде 81,5%
П р и м е р 5. Получение LVS - А.ГО - Pro -Phe -Phe - Туг -NH2
А, Получение ди 2Г-Lys - Arg - -Phe -Phe-Туг -NH
Процедуру из 4А повторяют с тем исключением, что вместо Z - - -Асар-ОН используют 390 мг ди-Z - Цб-ОН, в результате, чего получают 932 мг указанного соединения, имекнцего т.пл. 103-105«С;IdL -28,5° (с 1,О4%, ДМФ).
Найдено, %; С 6О,64; Н 6,21; N11,7 5 2,82
6oH.iOi.N,V
Вычислено, %: С 6О,39; Н 6,43; N 11,56; Ь2,41 Б. Получение Lys - Arg - Pro - Phe -
-Phe -Tyr-NH
500 МГ ДИ- 2 -производного пептида, полученного в примере А обрабатывают по примеру 2Б, в результате чего пoлyчiJOт 336 мг указанного соединения г -52,60С (с 0,57%, вода).
Аминокислотный анализ: Lvs l,O2;AiPcr О,98; Pro l.OO; 0,94;Phe 2,04 (со/лвржание пептида 91%).
П р и м е р 6. Получение Ы,) -Ра6 - Аг Pro phe - Pha -Tvr -- NHa10
Аналогично примерам 4 и 5, нс исхплй из 535 мг ди- г - d - I-Boib -/ иптелпгексиламмонийноР соли, синтезирэв/чио укпзанное соединение с выходом 325 мг,.58, ( с О,5О%, вода).
Аминокислотный анализ: сА. , тр - Dab 1,00; Afg- 0,98; Pho 1,OO; 0,87; Phe 1,96 (содержание пептида P4,2%). П р и м е р 7. Получение yfl - Ate --Ar -Pfo--Phe-РЬе-Туг-Nilj,А. Получение Z-/6 -А(л - Лга (hiOp) -Рго-оМе.
К 3,50 г Z-ApQ(M02)-Pro-OMe прибавляют 35 мл 25%-ного раствора
HBf в ледяной уксусной кислоте, Реакпионную смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 35 мин. К этой смеси прибавляют 300 мл диэтилового эфира, образовавшийся при этом осадок отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Полученный порошок растворяют в 20 мл ДМФ и при охлаждении на ледяной бане нейтрализуют раствором триэтиламиыа. Зат&л прибавляют 2,9 г 2.- |Ъ Atoi-ONB и
перемешивают в течение 16 ч. ДЧФ отгоняют при пониженном давлении, остаток растворяют в ЗОО мл этилапетата. Полученный раствор трижды промывают 4%-нь { водным раствором бикарбоната натрия (порПИИ по 10О мл). После промывки водой раствор сушат над безводньп л сульфатом натрия. Растворитель отгоняют при пониженном давлении и к остатку добавляют этиловый эфир. Полученное при этом порпшкообразное вещество отделяют от маточного раствора фильтрованием. Выход продукта 3,О5 г (74,3% от теоретического), т.пл. 62-65оС; Л 1 -34,1° (с 1,04%, ). Найдено, %: С 50,98; Н 6,36; N 17,72
..О
Вычислено, о: С 50,73, Н 0,21-,
N 18,01
Б. Получение г-ув-ЛЬг-Аг(ЯОд)-Pro-ОНВ ЗО мл ацетона растворяют 2,82 г Z-y3-A(a ApgCKOg)Po-OMe , к полученному раствору, охлажденному на ледяной бане, прибавляют 10,7 мл 1 н. водного раствора гидроокиси натрия. Реакци- оиную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем смесь нейтрализуют 11 мл 1 н. соляной кислоты,
раствор упаривают при пошгженном давлении.
к полученному маслянисток(у остатку прибавляют ЗО мл холодной воды и водный слой отделяют дека1ггацией. Остаток гфомывают один раз холодной водой и cyuiaT., после чего этот продукт хроматэгр-афНУ
на колонке с силикагелем (ЬК) i), и.и- льзуя в качестве элюента систему этилацетат/пиридин/уксусная киспота/вода (60: :20:6:11). Фракции, обогаще1гаые ожидаемым соединением, объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток промывают этиловым эфиром и отфильтровывают. Выход продукта, 2,62 г; т.пл. e5-67°C;td3|i -27,5 (с 1,О7%; ДМФ Найдено, %: С 5O,4i; Н 8,19; N 18,58 , Вьгшслено, %; С 50,66, Н 5,99, N 18,80. С. Получение Z- - Ata - Afg (MOgV -.Pro- Phe -Phe - Tyr -NHg 1.50 г Z-Phe -Phe-Typ-NHg растворяют в 15 мл ДМФ, гидрируют над палладиевой чернью в течение 4 ч. Катализатор отфяпьтровьшают, фильтрат охлаждают на бане со льдом и к охлажденному раствору прибавляют при перемешивании 1.21 г г-/ АГа Аг§Ш02)-Рго-ОН, 0,53 г НОН В и 0,61 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 18 ч. обрадовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают и фильтрат упаривают при понижен ном давлении. К остатку прибавляют 5Омл воды, фиш труют, осадок собирают, сушат Переосаждают из ДМФ этилацетатом. Выход продукта 1,99 г (8О,9% от теоретического); Т.ПЛ. 135-1380С, -33,1° (с 0,9, ДМФ). Найдено, %: С 58,93; Н 6,18; N 15,0 t4.vO..VH20 Вычислено, %: С 59,08; Н 6,17; N15,47 1.Z-p-A1a-Ap(N02)-Ppo Z- -Ala-Afi-iJJOg) -РРО p- Ma ppo - Phe 2.Zr-p-Ala Ap#0 02)--Pio Z-p-Alo-Arg-lNOg) -Pf« ;p -Ala-Aff-PiHj -Phe 3.Z-p -Alu - -t-HPr HCl Z -p - Ala P -Ala Д. Получение уй- Ala - A(g - Рро - phe - Phe - Tyf-NHg В 40 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 1,50 г г-/- Д а-Aг§fN02)- РРО РЬе - Phe -Туг -NHj, отщепляют Z -защитную группу гидрогенолнэом (над палладиевой чернью в течение 8 ч), Катализатор отфильтровывают и 4яльтрат упаривают прп пониженном давлении. OcTaToji растворяют в 50 мл воды, отфильтровывают небольшое количество нерастворившегося ветцества и ({мльтрат лиофилизуют. Лио(}я1лизованный продукт растворяют в 2О мл воды, полученный раствор наносят на колонку (3,OxS8 см) с карбоксиметнлпеллюлозой. Элюцию осуществляют гр адиентным методом с использованием О,005 и О,2 М водных растворов ацетата аммония {по 1,5 л каждого раствора). Фракции от 149О до 184О мл элюата объединяют и лиофилизуют. Выход продукта 98О мг (65,7% от теоретического); сА. i. -59,1 (с 0,52%, вода). Л Найдено, %: С 54,34, Н 6,98; N13,98 С4-,уЛ о-2ЧН,0, Вычислено, %: С 54,53; Н 7,12; N14,13 Аминокислотный анализ: Atgr ,ОО; 1,11;Т)Г 1,ОО; Phe 2,11; fi-AEa О,94 (содержание пептида в образце 75,7%). Аналогично примерам С и Д то же целевое соединение можно получить в соответствии со следующей реакционной схемой -Phe-T -Mlg JHONB/DCC -Phe -Tyi- -TSflia I H2/Pd ил HF Tyf phe-OH -t-H-Tyt I HONB/БСС Phe -Tyr -MIg I Hs/Fd. или HF -Тур -NHa e -Phe -Tyf -NHg I HONB/DCC -Ргн)-Р11в-РЬе-Тур-ТМНг I H2/Pd - Pro -Phe -Ptie -T r-NHg Получение - Aia - П р и м е р - Arg - Pro - Ptie Phe - MHg. Аналогично примеру 7, но с заменой Н- РЬе - Phe - Туг NHjна Phe - NHj; получают 1,24 г указанного соединения в виде белого пушистого продукта-, dlj- -48,6° (с 0,42% вода). Аминокислотный анализ: 1, 1.ОО; Phe 1,98; p-APoiO,97 (сод жание пептида 82,6%). П р и м е р 9. Получение & - Ма - Afg -ЛЬ - Рйе - РЬе - 1 -NHg . А. Получение Л - б - Afoi - РЬе - -Phe -Туг -NHj. 2,00 г Z- Phe - Phe - Туг - NHj растворяют в 4О мл ДМФ и гидрирукп над палладиевой чернью в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают и к фильтрату пр бавляют 1,39 г Z-p«-ACa-ONB , Реак ционную смесь перемешивают в течение 9 ч и ДМФ отгоняют при пониженном давлении. К остатку прибавляют 50 мл воды, получившийся при этом порошок отделяют фильтрованием и сушат. Полученный продууст i, чистят перекристаллизацией из смеси ДМФ /этилацетат. Выход продукта 2,О2 г (88,0 от теоретического)-; т.пл. 232°С; A.,(с 0,94%: ДМФ). Найдено,%: С 65,18; Н 6,20. N 10,32 .т Вычислено,%: С 65,41; Н 6,21, N1O,O Б. Получение Z ArgCNOa) в - Phe - Phe - Tyi- - NHg В 30мл ДМФ растворяют 1,0 г 2-ув - -Ala-Phe -Phe-Туг-K II и, используя палладиевую чернь в качестве катализатора гидрируют в течение 6 ч. Катализатсф сугфильтровьтают и к фильтрату прибавлшот раствор 2-Arg CNOj)-OT)NPв тетра гидрофуране (указанный динитрофениповьй эфир получен из 0,52 г Z-Afg-CNOj)-ON и 0,ЗО г 2.4-диш1трофенола в 10 мл тетр гидрофурана дишжлогексилкарбодиимидным методом). Реакционную смесь перемешивают в течение 13 ч,,растворитель отгоняют в вакууме. К остатку прибавляют 50 мл воды, полученное порошкообразное веществ отфильтровывают и сушат. Выход продукта: 1,01 г (74,9% от теоретического); тлл. 192-194оС;1л -11.1° (с 1,О2%( П л ,N Ч N15,61 Найдено,%: G 57,63; Н 5,93; C44 20ioV2H20 Вычислено, С 57,63; Н 6.16; N15,28 Z-y6-AJo-Arg(NOa)С,. П олучение Phe -Txjr-NHg, -/-Ala - Phe 575 К 700 мг 2- - - Аг§ (NOg) -/-Ala -Phe-Phe -Туг NHg, прибавляют 0,2 мл анизола и вспод за эткм 7 мл 25%HBf в ледяной %т сусяой кислоте. Смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин, после чего к ней прибавляют 1ОО мл этилового эфира, выпавший при этом (х;адок отфильтровывают и промьтают на фильтре этилов1 гк-1 э4Иром. Осадок тщательно высупгквают. растворяют в 10 мл ДМФ и при охлажленгаи льдом нейтрализуют раствор тризтнпа п ном. Вслед за этнм в реакционную cHcreNiy вводят 336 мг Z-p -AEa-ON5.и раствор п емешивают в течение 18 ч. В ллльнрйшем отгоняют ДМФ при понггкеннэь д /Влении и к остатку после ртариваиия реакционного раствора прибавляют ПО мл волы. Образовавшийся при этом осадок отделяют фильтрованием, суишт и пересажппкгг из ДМФ и этилацетата. Выхол прод к:та 56О мг (73% от теоретического); т.пл. 2ОО-202°С (разложение); -7,3 (с О,9Т%; ). Найдено,%: С 58,Об; Н 6,41; N 15 .v.o Вьгчислено,%: С 58.19; Н 6,13; N 15,89 Д. Получение - -Arg - & - - Phe - Phe Tvr - NHa В ЗО мл ледяной уксусной кислоты растьоршот 400 мг защюцешюго пептида 2. - Ata - Ajg(NOa)-/-AlQ-Pha -РЬе Р-НН,и, используя в качестве ката;;кзатора палладиевую чернь, гидр5фуют в течение 8 ч. Катализатор удаляют фильтрованием, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворзпот в 5 мл и полученный раствор наносят на колонку (2, 6 X 22см) с карбоксиметилцеллюлозой. Градиентную элюцию проводят с использованием О,ОО5 и О,2 М водных растворов ацетата аммония (по 7ОО мп каждого раствора). Фракции элюата от 72О до 87О мл объединяют HI дигх шлизуют. Полу чают 27О ыг (69,1% от теоретического), белого пушистого продукта; ел.™ -17,2°, (с 0,53%, вода). Найдено,%: С 54,52; Н 6,96; N15,00 39W 2S o2CгH40,-ЗH,Q Вычислено.%: С 54,53; Н 7,03; N14,79 Аминокислотный анализ: AVg 1,ОО. Таг 1,ОО; he 2,03; р-АЕа 2,14 (содержание пептида 79,О%). Пример 1О. Получение Ага-Arg;3-Afa - Phe - Phe - Tvf -МНг. Аналогично примеру 9С, но с заменой I-ji-AEa-ONBна 34О ZvAKa-ONB,
15
получают 297 мг указанного соединения в виде белого пуишстого порошка; АЗ -18,9 (с 0,62%, вода). .
Аминокислотный анализ: 1,02; АЙа 1,04; 0,97. Phe 2,0: j%-Деа 6,97 (содержание пет-ида 81,0%),
ПрнмврЦ. Получение : й Мл - --Аг§-$аГ-РНе -Phe - TVr-NHa.
А. Получение 2- Sap - Phe - Phe -Ttfp-HHg.
В SO мл ДМФ растворяют 2,02 г Z -Phe-THe-T-s.p-NHg а, нспользун в качестве катализатора палдадиевую чериь, гидрир) в течение 5 ч. Катализатор отфильтровьдаают и фильтрат охлаждают. Отдельао pacTBOpssiyf 810 мг Z 5«г - ОИ в 10 МП тетрагадрофурана и к раствору добавляют 0,71 г HONB. Смесь озшаждают до О в прибавляют к ней 0,82 гДЦГКДИ Полученную реакционную смесь перемешивают в течение 3 ч. Образовавшуюся ДЦГМ отфйльчроаьюают, фильтрат прибавляют к охлажденному днметнпформамндному раствору. Смесь перемешивают в течение 2О ч, после чего растворитель отгоняют при поаиженном давлении н к остатку прибавляют 5О мл воды. Полученное при этом порошкообразное вещество отделяют фильтрованной и переосаждают из смеси ДМФ/этиладетат. Выход продукта 1,90 г (83,8% от теоретн ческого), тлл. 246-248°С (разложение); Ир -9,7 (с 1,07%; ДМФ),
Наадеио,%: С 66,32, Н 6,39; N 1О,52 ,W -1i2H,0
Вычислено,%; С-66,26Г Н 6Д5; N10,17 Б. Получение Z - АгоСКОг) - Sar - РЬе-РЬе - Туг-NRg.
В 1О мл ДМФ растворяют 1,О г Е-Sar- Phe - Phe -Туг -NHg и, используя в качестве каташгзатора палпадневую чергоз, гидрируют в течение 7 ч. Катализатор отфильтровывают и фильтрат охлаждают. Перед этим в отдельной реакпионнойсистеме растворяют О,52 г Z-Arg-CNOjVOH в 10 мл тетрагвдрофурана н при охлаждении льдом прибавляют к раствору 0,3 г 2,4-ди нитрофенола и 0,33 г ДЦГКДИ. Реакцион ную смесь перемешивают в течение 3 ч, образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают и фильтрат прибавляют к диметилформамидному раствору. Смесь перемешивают в .течение 2О ч н упаривают при пониженном давлении, К остатку прибавляют 5О мл воды и образовавшийся при этом осадок отфильтровывают. После высушивания полученное порошкообразное вещество иерееюаждают из смеси ДМФ/этилацетат/этиловый эфир. Выход продукта 1,04 г (77,2% от теоретического): т.пл. 96-980С, 1 7,3° (с 1,06%; ДМФ).
16
Найдено,%: С 57,60-; Н 6,1О; N15,01 .о 10-2Н,0
Вычислено,%: С 57,63, Н 6,16, N15,26 С. Получение Z- jS Ма - Аг§ (N0) - - Sap -- Phe - Phe - Туг - NH.
В 7 мл 25%-ного в ледяной уксусной кислоте растворяют 7ОО мг Z. -
-ArgOl02)-Sar-Pie- h TjPi-NH2 н 0,2 мл анизола и раствор встряхивают при комнатной температуре в течение 4О мин. К реакционной смеси прибавляют 100 мл этилового эфира, и полученный осадок отфильтровьгоают, промьшают на фильтре эфгром н сушат над гранулированной гидроокисью натрия в течение 2ч.
Вьюушекный осадок растворяют в 10 мл ДМФ, раствор охлаждают на ледяной бане и нейтрализуют триэтиламином. Затем прибйвляют 336 мг 2-p -Aecj-ONB и раствор перемешивают в течение 2О ч. После этого растворитель (ДМФ) отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют 50 мл воды. Полученный при этом порошкообразный осадок отфильтровывают и после высушивания переосаждавэт из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 59Ом (76,5% от теоретического) г т,пл. 1351380С; 3| -15,50 (с 0,99%, ДМФ).
Найдено,%: С 58,18; Н 6,40; N 15,6О
. iV
HjO
Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13; N15,89 Д. Получение j$ - Ala - Arg - Sar - - Phe - Phe Tyr - NH.
В 30 мл уксусной кислоты растворяют 45О мг защищенного пептидного производного Z-/-Afa-A -Sa --Phe-Pbe-Tyr-NHj, и в присутствии палладиевой черни гидрируют в течение 8 ч. Катализатор от- фильтровьтают и фильтрат коннентрируют в вакууме досуха. Остаток растворяют в 5 мл воды ихроматографируют на колонке (2,6 х X 22 см), заполненной карбоксимбшлнеллюлозой. Градиентную элюцию проводят с использованием О,ОО5 и О,2М водных растворов адетата аммония (700 мл каждого раствора), причем целевое соединение выходило из колонки во фракциях от 770 до 880 мл. Эти фракции объединяют и лиофияизуют. Получено ЗО9 мг (7О,4% от теоретического) белого пушистого продукта, ,5°(с 0,46%; вода). Найдено,%: С 54,99; Н 6,76: N14,58 C,.H,,,,2.C,H,0,-3H,0
Вычислено,%: С 54.53; Н7,03; N 14,79
Амииокислотный анализ: ,OO;Tsr 0.88; Phe 2,О2; |ЬтАЕа 0,98) Soi(« не определялся (содержание пептида 78,7%),
Прим ер 12. Получение J,eu - Ar§ - -Pro -Phe - рКе - Tvr - NH,, 17 А. Получение Н - Leu - fgCNOg) - -Pro -РЬс - Phe - Туг- MHg. В 20 мл растворяют 7ОО мг Z P)ie Phe-Т г-NHp и нал пал-. ладиевой чернью в течение 6 ч. Каталкзятор отфильтровывают и фильтрат охлажда от К этому фильтрату прибавляют 648 мг карбсжснльяого компонента 2-Leu-A g(fIO Pro-OH, а затем 247 мг НО11 В и 285м Д11ГКДИ. Смесь йеремешива от в течение 2О ч, образовавогийся осапок дишгк-ЛО екснпмочевйны отфильтровывают н отгоняют при ионижешзом аавяения. К остатку прибавляют 5О мл вояы и полученное псфошкообразное вйаество переносят на льтр. Продукт сушат и переосажлают из салеси ДМФ/этиладетат/эфир| глп. 110lll t; d -38Д° (с 1,0%; ЯМФ). Выход продукта 1,О5 г (80,5% от теоретического) , Найдено,%: С 59,24; Н 6,50; Н 14,62 ..-2H20 Вьп1ислено.%:С59ДЗ; Н 6,59; N 14,59 Б. Получение Lea - Кг§- Pro - Phis --РЬе- TVP- NHg. В 2О мл уксусной кислоты растворяют 5 мг защищенного пептида Z-Leti-irg( -FVo - Phe -РЬе - TV и восста- навяивают в присутх:твт5 палладиезой черни в течение 10 ч. Катализатор отфжяьт- ровывают и фильтрат кониентрирутот досуха при пониженном давлений. Остаток раствэ-- ряют в 5 мл воды а хромат ограф5ср {: -т на колонке (2,6x2Oe fK заполненной кар-6оЕ- силметилцеллюлозой.Градиеитаую snsssissj проводят с использованием О.ООб и О,2М воднь х растворов ацетата аммония (пэ ТОО мл каждого раствора). Целевой продукт выходит из КОЛОНКИ во фракциях от 7ОО до 790 мл. Фракции объединяют н пиофялиэируют. В итоге поззучавэт ЗОО мг (63,6% от теоретического) белого пушистого продукта; 1 -58,3° (с 0,59%; вода). Найдено,%: С 57,72, Н 7,24; N14,25 Ч4.о07 10-2СА3,-2Н,0 Вычислено,%: С 57,81; Н 7,28; N 14,05 Аминокислотный анализ: Дгр1,07;Рю 1,03; T)r 0,87; Phe 2,07M€u 1,00 (содержание пептида 83,9%). Пример 13. Получение -Ata -Аг§ -РЬе - Phe - Phe - MHg. Л. Получение Н- - SLP§(NOg) phe-Pbe-Phe-Туг(В2Г)-смолы. В реактор твердофазного пептидного сил тезатора загружают 4,33 г ВрС-ТУг(Ы1 -смолы (содержание Т1фоаина 2,18 ксмоль дают ей набухнуть в дихлэрметане, одят в указанном порядке БОС- Ph -ОН, ВОС.„Phe «ОН. ВОС- Рг;е-О ;, ВОС-A yЧKCiJ,v OH я 2-j:.-AeO:-Gli , : CM4t-:: :-::.- I..:;.;.-. ппгваггке попгнлнзй аеп;: ,:----;:.v.-:tf K:::::;.:iocДИИМИдКЫ ; CHDCODOvi в С05Т;М ТС аП;; Г МО-ТОПгТ ОЙ, paspacDTfilil-IOil Л1€- ;:--5Ь ЛМ, К -;-по SeBGDHJOfillfT BCS7 П; й ГТ ; i :.П ii - вают ляхпорметакзт-;. Ц:-1 -; г;.:±;), л;-ПЯНОЙ уксусной кИСЛСгТОЙ П .П Т,Г ОГОТ., сушат В П&ЗУЛУТЗТЗ i O rv ; Tf-r О,on Г «1епП5дсая8ржо1Еои , Б, noHT sGiiHo Z-- и --nfa -- А,ч; . ;.:. i -Phs -РЬе -Phe -TvrCE: ;. --:-;1;-,-: р.гешпЕЗют прк ломнвткэ . :- -кчен15е iS ч. C.-unv о- чЬнль-у; : ;-:-:,.:-: /-::- ;;.трат упарнзак т дгсухс пр:; nL:-;iiiv; -;r,..j-- n-iivггеш{н К остйлт;;, гшкбь -пкг: т ;;;; ::П 4;;г, осадэк огфтйпг трозлваот ;; гу ;;;v. :- -i«r: продукта S, на г , С. Пэлуче; и-э д , -- Ьf -Phe --- Phe -IvV ,, В ЗО мл яедпп:: :г ч-тсуЬко-;; ..-acvv rvac-Tмере Б и вссстаяавлиБс чернью в течсн.гс 10ч фзшьтроаьхйэют . :; фпльт ха пру г оигжонном дап БСряют в о Mil в:;дг- р понку (2,8 л 24; 5: 5 оа;; С15мета;1; е юл;-лэ}, Гтт;-; upSBDu T с :С-;ОПЬЗС-П::;Н; 8ОО лШ ка-сдсг: -jso-: ЗЕругот« Выход целевого .. la :-j ; ;.i С 64% от теоретичажэгэ); d ;, ЗЭ , 19° (с 0,46%; аода). . Найдено С 5S.44; Н 6, N 12,86 С,,0.,; Г. )ч,0 Вычислено,%t С 58,44; li 6,81; N 12,52 Аминокислотный аналиа: ,ОО; Isif 0,81; Fbs 3,20; р-ДЕе о,9 содержа Ш5е пеатиля 84,8%), Пример 14 Г1олуче:;й - -Arg -Leu - phe- Phe - TVi -Sty - KHn. A. Получение Z / - Aia - Sip (Tos) - -Leu -Pbe -Phe . В реактор твердофазного пеггтггдяого синтезатора ( SifT7Cii32U APS--SOO) помещают 4,0 г BOC-GPv - ::--и пы (содержащей 1,7 кмэль глицина), дают ей ка бухнутъ Б метнлеюслэртше в течеине 2О ч, В реактэр ввадят Е ytcaaaKKONi порядке BOC-Phe -ОН. ВОС- , РОС« Uu-ОН, Аос -Arg- (ToS))H и 7--р-АСа ОН, используя Б качестве кокденсирующегп агента, ДИГКДИ, а в качестве агента для отшеплеаия ВОС-защитной группы - смесь трифторуксусной киспЬты с метиленхлорндом е соотношении 1:1. После завершешш всех стадий твердофазного синтеза смолу npoMbiBaiOT метиленхлорвдом, ДМФ, метанол , ледяной уксусной кислотой, снова метаколоь и сушат .до постоянного веса. Выход пептндсодержадей смолы 5,09 г, Б, Получение Z- - ASa-А -(Tos)-Leu Phe Phe-T rCBHf) -МНаВ 5О МП раствора аммиака в метаноле суспендируют 4,4г пептидсс дер жащей смолы, полученной в примере А, сус пензшо помещают в ампулу, герметично ее залаивают. В таком виде суспензг-по перемешивают при комнатной температуре в те чение 48 ч. Смолу отфильтровывают и про мывают ДМФ, Фильтраты объединяют и коп центрирувэтдосуха , при понннсенном давлении. К яолучевному в остатке маслу прибавляют этиловый эфир, порошкообразный проду1ст отделают фильтрованием. Выход 95О мг. С. Получение -At« Arg-Leu- We - Phe - Туг - - NHg. Смесъ из 500 мг сьфого ааппацеш{ого пептид-амида, полученного в примере Б, 0,5 мл анизола прибавляют ,к 1О мл фто .ристого водорода. Смесь перемешивают при осе в тече-1-ще 60 мин, фтористый водород отгоняют в вакууме. Остаток растворяют в 50 мл воды. Раствор промьшают дважды 20 мл этилового эфира, затем .пропускают через колонку (1 х 10 см) с Амберлит .JRA-410 в ацетатной форме и лиофиянэуют. Лиофилизованный продукт растворают в 20 мл и раствор вводят в колонку (2,6 X 25 см), заполненную карбоксим€ гил целлюлозой. Элюдию осуществляют градиен тным методом с использованием 0,О05 и 0,2 Л4 водных растворов ацетата аммония (по 800 мл каждого раствора). Фракции элюата от 12ОО до 153О .мл объединяют и лиофилиз тот. Получают 167 мг белого пушистого продукта; di} -28,93° (с 0,6%; вода). . Найдено,%: С 54,64; Н 7,58; Н 14,37 Л.ОеЫ,,-2С,Н402-ЗМ20 Вычислено„%:С54,64; Н 7,26; N 14,60 Аминокислотный анализ;- Afg1,О6; GEv 1,00; Ьеи 1Д1; ТУГ 0,87; he 2,09 p -ABai,l4 (содержание пептида 82,О%) Пример 15. Получение АРа -Arg-Sei-Phe - Phe -Туг -NHgA. Получение Z -/ -Arg (ToS)-S (,BZO Phe-Phe -Туг (BZ) - -смолы, В реактор твердофазного пептидного си тезатора загружают 4,02 г ВОС- лы (содержащей 2,17 ммолъ глицина) и 6ВОДЯТ Б указанной последовательности следующие карбоксизтьные компоненты: ВОС Ti;r( В211)оп, ВОС- Phe -ОН, всю-PheuDH, ВОС- Ser-(BZl)-OH, Аос- Ar-g(То&)Н и Г-{Ь -Деа-ОН , осуществляя наращивание пептидной цепи по методу Мери(})ильда. После завершения всех стадий твердофазного синтеза смолу промывают метиленхлоридом, метанолом, ДМФ, яедя- ной уксусной кислотой, снова метанолом и сушаТо Выход пептидсодержашей смолы 6,4 г, Б, Получение - Arg (T6S)- -gerCBie -Pte-Phe-Tvs-CBZO-Gtv-NHa. В 50 мл раствора аммиака в метаноле суспендируют 5,9 г пептидеодержащей смолы, полученной..в-примере А, и суспензию перемешивают, при комнатной температуре в течение 48 ч. Смолу отфильтровывают и промывают ДМФ. Промывные воды объединяют с фильтратом и полученный объединенный раствор упаривают досуха при пониженном давлении. К остатку прибавляют этиловый эфир, а осадок отфильтровывают. Выход продукта 2,О2 г. С, Получение jB Alo. - Arg - Ser - -РЬе Phe Туг - - NHg. В 10 мл безводного фтористого водорода растворяют . 1,0 г сырого (неочищенного), защищенного пептид-амида, полученного в примере Б, прибавляют к раствору 1 мл анизола, смесь перемешивают при в течение 6О мин. Фтористый водород отгоHfflOT при понгокенном давлении, а остаток растворяют в 2О мл воды. Полученный раствор дважды промьгоают 10 мл порциями диэтилового эфира и пропускают через колонку с Амберлитом ,JRA 410, элюат лио- филизируют. Лиофилизованный продукт растворяют в 10 мл воды и раствор вводят в хроматографическую колонку (2,5 х 25 см), заполненную карбоксиметилцеллюлозой. Злюнию осуществляют градиентным методом с использованием 0,005 и 0,2 М водных растворов ацетата аммония (по 800 мл калвдого раствора). Фракции элюата от 80О до 950 мл объединяют и лиофилизуют. После этого продукт пропускают через колонку (2 X 10 см) с Амберлитом ХАД-2 в водном растворе и лиофилизуют. Получают 55 мг палевого соединения в виде белого пушистого порошка; oL j. -30,11(с 0,47;Бода. Аминокислотный анализ; ,04; &ег 0,96: Q.y 1,00; Туг 0,88; The 2,10; pj-AEa Ъ,98 (содержание пептида 83,0%), Прим ер 16. Получение -Ata - -Af g - Pro -Phe -Phe -Тур -Thr -Pro - Lys - APa -OH. В 30 мл метанола растворяют 1,16 г 2-phe -Phe -Тур -Thr -Pro - LV& (ВОО)-Afa -OtBu и восстанавливают в присут21
ствии палладиевой черни в течение 4 ч. Катализатор отфильтровывают, а фильтрат концентрируют дсюуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 15 мл ДМФ. К раствору прибавляют 492 мг 2-|S-AEa-Ahg-tNOjVPfo-OHHaOO мг НОМВ, охлажцают и в реакционную массу вводят 25О мг ДЦГКДИ. Полу1енную смесь перемешивают в в течение 18 час. Нерастворившиеся примеси отфильтровывают и ДМФ отгоняют при пониженном давлении. К остатку прибавляют этилацетат, осадок отфильтровьшают и сушат до постоянного веса. Сухой продукт растворяют в 10 мл трифторуксусной кислоты. Раствор оставляют стоять на 4О мин затем трифторуксусную кислоту отго1шют при пониженном давлении, остаток растворяют в ЗО мл ледяной уксусной кислоты. Восстанавливают в присутствии палладиевой черни в течение 16ч. Катализатор отфитштровьгоают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 МП воды и раствор пропускают через колонку с Амберлитом ТКЛ-41О. Раствор фильтруют, фильтрат вводят в хроматографическую колонку (2,2 х 30 см), заполненную карбоксиметилаелпюлозой. Градиентрую элюцию проводят с использованием 0,ОО5 и 0,2 М водных растворов ацетата аммония (по 80О мл каждого раствора), фракцииот 82О до 1180 мл объединяют и лиофилизуют. Получают 670 мг целевого продукта в виде белого пушистого порошка. Аминокислотный анализ: LvS 1,О2; Afg 0,98; Thf 0,96; PJO 2,О4; ACq 1,OO; Tsi 0,87; Phe 2,02; p -Aeot i,05 (содержание пептида в образце 74%).
n р и м е р17. Получение - Ala -
- Afg - G у - Phe -Ph е - Ту г - Leu - ОН.
А. Синтез I-Ptie-Phe -Tyn-OEt. .
3,43 г Z-РНе-Таг - OEt растворяю в 5О мл этанола и гидрируют в присутствии палладиевой черни в течение 3ч. Катализатор отфильтровьшают, раствор упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 15 мл ДМФ и к раствору прибавляют 2,77 г i.-Phe-Osi/ Реакционную смесь перемешивают в течение 10ч. добавляют 8О мл воды, образовавшийся при этом кристаллический продукт отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси этанол/этилацетат/этиловый эфир. Получают 3,72 г (83,4% от теоретического) указанного пептидного производного в виде игольчатых кристаллов с т.пл. 185-18бС; Я 15-18;1° (с 1,09%; ДМФ).
Найдено.%: С 69,64; Н 6,14; N 6,54.
.0,N, Вычислено,%: С 69,68; Н 6,16; N 6,59
22
Б. Синтез Z-/ --Ala--Ar§CN02) -ety РНе - Phe -Туг .
В 5О мл этанола суспендпруют 2,0 г Z-Phe-Phe-Tsr-OEt и в течение 1,5 ч проводят его каталитическое восстановление в присутствии палладиевой черни. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме с целью отгонки растворителя. Остаток растворяют в 20 мл ДМФ. К полученному раствору, охлажденн; му нл ледяной бане, прибавляют 1,56 г Z р -Aeo)-A g-CNO)-Q,-OH, о,7 г HONB и 0,8 г ДЦГКДИ и смесь перемешивают в течение 12ч. Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, раствор упаривают при пониженном давлении и к остатку прибавляют 6О мл воды. Полученное при этом порошкообразное вещество отфильтровывают, сушат и пересаждают из смеси ДЛ Ф/этилацетат. Выход продукта 2,58 г (82% от теоретического), Т.ПЛ. 83-85°С; d -lO.O (с 1,1%; ДМФ).
Найдено,%: С 57,41; Н 6,О5; N 14,49
Вычислено,%:С 57,43;Н6,23; Н 13,П
С. Синтез Z-/-А а - AJ-§ (NOg) - Gty РЬе -Phe -Tvr -ОН.
К охлажденной льдом суспензии 2,0(J г защргщенного пептида Ж - J - Afa - Arg (KO-€llV-Pbc.-PhG-Tvr-OEt в ЗО мл аиотоиа прибавл$пот 6,3 мл 1 М водный раствор гидроокиси натрия, смесь перетч ешивают при комнатной температуре в тепенке 1 ч. После добавления 3 мл 1 н. соляной кислоты ацетон отгоняют при пониженного /UIBлении. Незначительное количество не{)астворршшегося вещества отфильтровьшают и к фильтрату прибавляют 3,8 мл 1 н. солииой кислоты. Выпавший при этом осадок отфильтровывают, тщательно промьгеают холодной водой и сушат. Выход продукте 1,96 г 198% от теоретического); та:л. продукта 70-73°С; -8,7° (с 0,97 ДМФ).
Найдено,%: С 58,13; Н 5,89; N14,51
. Н,0
Вычислено,%:С57,77: Н 6,90; Ы14,64 Д. Синтез г-/- Ata-AfgCNOg) -Gb}- Phe - Phe - Tyi- - Leu - OBz.
В 5 мл ДМФ растворяют 275 мг Н- 1еи-OBz6 П -толуолсульфоната, раствор нейтрализуют 0,9 мл 1О%-ного раствора N -этилморфолина в ДМФ. В реакционную смесь, охпажденную до , последовательно вводят 670 мг Z-jЪ-A ot-Afg-CNO)-Gf ;-Phe-Phe-T r- 251 мг FiONB и 289 мг ДНГКДМ, перемешивают в точение 12 ч, образовавшуюся ДИГМ отфильтровывают и ДМФ из фильтрата от23гоняют при пониженном давлении К остатку прибавляют 30 мл воды, юлу енный осадок отфильтровывают, промывают горячим метанолом и сушат. Выход продукта 703 мг (87,9% от теоретического); т.пл, 178-1810С; ,0° (с 1,02%; ДМФ). НайденоД: С 61.88, Н 6,78; N 13,15 ,.. Вычиспено,%:С 61,98;Н6.35; N13,49 Е. nonj jeHHe - Аг§ - Qty - - Phe - Phe - Туг - Leu - ОН. В 30 мл уксусной кислоты растворяют 5ОО мг E-/-A «i-Arg(M02)- St-s-Phe P{ie ,etJ-UB2 и в гфисутствии паплад иевой черни гидрируют в течение 8 ч. Катализатор отфильтровывают и растворитель отгоняют при пошокенном давлении. Остаток растворяют в 5 мл воды и полученный раствор вводят в колонку (2,6х X 18 см),I еаполнеш1ую карбоксиметипцеллголоэой. Эпгоцию осуществляют линейноградиентным методом с использованием О,ОО5 М водного раствора ацетата аммония {70О мл) и 0,2 М-водного раствора ацетата аммония (70О мп). Целевое соединение собирают во фракш1ях от 37О до 72О мл. Эти фракции объединяют и лио фипизуют. Выход продукта 277 мг (64,2% от теоретического); Го(.3 -32.5° (с 0.5196; вода), Найдено,%: С 55.8О; Н 7,20; N 14,17 « Ло о-СгН ОгЭН.О Вычислено,%:С55,97;Н7Д5; Ы 14Д9 Аминокислотный анализ: .OO; QEv 1.О4; Uu 1.О8; Phe 2,16; 0,88; () - AEoi 1,04 (содержание пептвда 85,9 Пример 18. Полу11:ение - f sl-Gty-Phe-Phe-TYr - Л а-NHg. Методш у, описанную в примере 17 вос производят с тем отличием, что вместо H Leu OBzC-n -толуолсульфоната нспол зуют Н NHj-гидрохлорид. В итоге получают целевой гепрапептид р-Аеа-Ah G. Phe-Pfie-Tyr-ACa-WH -диацетата с выходом 216 мг. Аминокислотный анализ: 1,01, ( 1,00; AEoi 1,02: Phe 2,00,-TNC 0,8 |-Ь - Аба 1,12 (содержание пептида в образце 82,4%). . Пример 19. Получение Ma -Afg- Gfy-Phe- РЬе-Tvr-Thr-Pro- ОН Л. Синтез Z-P)1e-Phe-Tilr-Thr-P o Oigu - 1,80 г Z-Thr-Pro - OtBu растворяют в 30 мл метанола, падрируют в течение 5 час в присутствии палладиевой черни. Катализатор отфильтровьшают, а
24 астворитель отгоняют при пониженном давлейии. Остаток растворяют в 20 мл , раствор охлаждают до и при перемешивании и охлаждении последовательно прибавляют 2,70 г Z-Phe-Phe-Т г - ОН, 1,59 г НО MB и 1,37 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 18ч образовавшуюся Д1ДГМ отфильтровывают в к фильтрату добавляют lOO мл воды. Осадок отделяют фильтрованием, промывают. и растворяют в 1ОО мл этилацетата. Полученный раствор дважды промывают 50 мл воды и сушат над безводным сульфатом натрия. Растворитель отгоняют в ва.кууме, а к остатку прибавляют этилацетат. ббразовавшийёй ;при этом порошкообразный продукт переносят на фильтр и сушат. Выход продукта 2,51 г 189,8% от теоретического); т.пл. 137-139°С; ,l° (с 1.08%; ДМФ). Найдено,%: С 65,49; Н 6,82; М 7,91 .o.- Вычислено,%:С 65,36lH 6,74; N 7,94 Б. Синтез .-Ac§CNa2)Qfy- -Phe-Phe -Тур -Thr-Pro - OtBu. В 2O мл метанола растворяют 1,5О г Z- he-Phe-7:y -P o- OtBu, пшрируют в течение 4 ч над палладиевой чернью. После этого катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл ДМФ, раствор охлаждают в ледяной бане и прибавляют при перемешивании 0,87 г 2-|Ь- Ahg-(N02:)-Gev-OH, 0,47 г HONB и О.54 г ДЦГКДИ, Реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч, образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, к фильтрату добавляют 5О мл воды. Образовавшийся гелеобразный; осадок отфильтровьшают, высушивают и переосаждают вначале из смеси ДМФ/этилацетат, затем из этанола. Выход продукта 1,40 г {67,4% от теоретического), т.пл. 153156°С; оС У -32,3° (с 0,97%, ДМФ). Найдено,%: С 58,24; Н 6,54; N13,87 C,9.0ir.2 Вычислено,%:С 58,50 Н 6,57; N 13,88 С. Получение -Afg - Gfy - Phe - Phe - Tyj Th - Pro - OH . К 900 мг Z- -Afa Ai«§ (WOй)-Gry-Phe-Phё -Tyf-Thr-Pfo-OtBu прибавляют 0.9 мл анизола, 10 мл безводного ({ггористого водорода, реакционную смесь перемешивают при температуре -4С в течение ЗО мин, фтористый водород отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют ЗО мл воды. Раствэр экстрагируют ЗО мл диэтилового эфира и водный слой вводят в колонну (1,0 X 1О,О см) заполненную Амберлитом JRA-4JO в ацетатной форме, которую промывают водой. Промывные воды объединяют с элюатом н объединенный раствор пиофилизнруют, Лнофилизированный продукт растворяют в 10 м воды, раствор пропускают через колонку (2,2 x21cMj c карбокснметнлпеллюлозой. Эяюцню осушествляют градиентным метопом с нспользованн 0,ОО5 М водного раствора ацетата аммония ( 7ОО мл) в О,3 М водного раствора ацетата аммония. Желаемое соединение выходит рз колонки во фракциях от 235 до 385 мл. Эти фрактат объединяют и тгаофилизнруют. Выход продукта 476 мг (57,О% от теоретического); t/lji -38,8° (с 0,25%; вода). Найдено,%: С 53,2 Т, Н 7,О4; N 13,82 ,,,. С. Вычислвйо,%:С 53,1О, Н 7,ОО; N 13,91 Амннокисйо яый анализ: 1,05, Th 1,ОО; ГО 1,02-. GrSv 0,95; TV г 0,95 Phe 2,02; р- Ata 0,93 {сод шание пептнда 85,5%). Пример 2О. Получение ft-Асор - -Arg-Gfjf -Pfce -Phe -Tjr-Thr - Pro -OH. A. Синтез Z -Acap-APS(NOe)-Qfy-OE К 2,41r Z-Af-g-CNOp-Qiv-OEt прибавляют 12 мл 25%-«ого раствора HBt в ледяной уксусной кислоте, смесь встряхивают пр комнатной темп атуре в течение 4О мин. К полученному раствору прибавляют дввти ловый эфир, вьшавший осадок отфильтровы вают и сушат в вакууме над гвдроокнсыо натрия. Перед этим в другой реакционной системе растворяют 1,33 г Асар-ОН и О,99 г HONB в 5 мл тетрагидрофурана н при охлаждении на ледяной бане прибавляют 1,14 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 4 ч и о азовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают. Подготовленный аминокомпонент растворяют а 10 мл ДМФ и нейтрализации раствора трнэтилами ном прибавляют к нему полученный раствор активированного эфира. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи, растворитель отгоняют в вакууме, остаток растворяют в 5О мл этилацетата. Раствор промывают водои, затем насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2 раза по 50 мл). По ле заключительной промывки водой органический слой сушат над безводным сульфатом натрия. Далее растворитель отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют петролейный эфир. Полученное при этом кристаллическое вещество перекрнс- гал; изовывают из смеси вода/этанол/зтил- ацетат. Выход продукта 2,1 г (76% от тео ретического), т.пл. 85-87 С; dl J -11,9° (с 1,0%; ДМФ). Найдено,%: С 52,43; Н 6,64; М 17,76 Вычйслено,%: С 52,26; Н 6,76; N 17,78 В. Синтез - e-Acop-ApjCNOal-eiv-OH 1.8 г Z- -Асар - APJJ СНОд) - Gty - ОЕ t растворяют в 10мл ацетона, раствор охлаждают на ледяной бане, к нему прибавляют 2,9 мл 2 н. водного раствора г дроокиси натрия. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем к смеси прибавляют 2,5 мл 1 н. соляной кислоты, ацетон отгоняют при пониженном давлении. Остаток разбавляют 10 мл воды, полученный раствор подкисляют 1 н, соляной кислотой. Вы павигее в осадок кристаллическое вещество от тльтровьгвают и cyiiiai. Выход продукта 1,59 г (93% от теоретического); т.пл. 97,5-99°С;.сА. 1 -1О,7 (с 1,0%; ДМФ). Найдено,%: С 48,5О; Н 6,28; N 1 8,23 Ч2. Вычислено,%:С 48,79,Н 6,52; N 18,К С. Получение - G{y -Phe-Pbe -T r-Thp-Pro-OH. Аналогично примеру 19 Б, но вместо ZJ fOf-Ahg-CNUjVC t OH используют Z - f - Асмр-A (NO)-GEv-OH и в дальнейшем по методике примера 19 Б и С получают 428 мг указанного соединения, dlj 7,9° (с 0,25% вода). Аминокислотный анализ: 1,02 Thp 1,02- Pro 1,00; stv 1,01;Phe 2,04; 0,92; -Acap не определяли (содержание пептида 84,9%). Пример 21. Получение .Lye -Arg - - aty-Pht -Ph -Туг-Т г-Pro -ОН. A. Синтез ди- Z - Lys - Arg (NOg) - -G y-OEt. Указанное соединение получакуг в виде геля по методике примера 20 А, исходя из 2,07 г дн- Z Lv&-OH , Гелеобраэный продукт переосаждают из смеси вода, /этанол/этилацетат. Выход продукта 2,57г (73% от теоретического) т.пл. 161-162°Ci d.,9° (с 1,0%; ДМФ). Найдено,%: С 54,45, Н 6,О5, N15,99 Вычислено,%: С 54,85; Н 6,33; Н 15.99 Б. Синтез ДИ-. Я-Ьуа - AгgCЫ.02 - -alt-OH. В 10 мл ацетона растворяют 2,0 г ди- Z-L S-Apg-CNOj -Ge -Ottи при охлаждении на ледяной бане к раствору прибавляют 2,1 мл 2 н. раствора пшроокиси натрия. Реакционную смесь перемеши27пают при комнатной температуре в течение 2 ч, прибавляют 1,4 мл 1 и. соляной кислоты, ацетон оп оняют при пониженном давлонии, к остатку добавляют 10 мл воды. Мррастворившиеся примеси отфильтровывают н фильтрат подкисляют 1 н. соляной кислотой. ВьтавшиЛ гелеобразный осадок отделяют фильтрованием. Выход продукта 1,78 г (93% от теоретического); тлш. 131132,50C;t l. -10.50 (с 1,0%,ДМФ) Найдено,%: С 51,43; Н 5.92; Н16.23 Вычислёно.%: С 51,491 Н 6,20; N 16,О2 С. Получение Lys-Ar -О --РЬе - - РЬе -Thr - Pro - ОН Методику примера 19 Б повторяют с тем отличием, что вместо 2 {i АВс -Afg (N0j GrEvOH используют ди- Z-bb- Arg(.NOj)-Otv-OH-B результате получают 452 мг указанного соединения; Л -34,8° (с 0,4%; вода). Аминокислотный анализ:. 1.08, At-cr 1,01.-Thr 0,92; Pto l.OO; (J€ l.OOj Phe 2.,O8; Tur 0,39 (содержание пептида 85.2%). Пример 22. Получение -Ata-Ar« (у- Phe-Phe-TV - - ТЬг - Pro-Lys-Ma-OR А. Синтез Z-Lv&(bOG)-Ae«-Otbu. 1,4 г I-AEoi-OtBu, растворенные в ЗОО мл метанола, гидрируют над палладиевой чернью в течение 2 ч. Катализатсф отфильтровывают, а метанол упаривают в вакууме. Остаток растворяют в 5О мл тетрагидрофурана. Отдельно от этого суспендируют 28.1 г Z-LvsCBUCV ОН дициклогексиламмонкйной соли в ЗОО мл этнладетата промывают суспензию в делительной воронке 20О мл 0,5 н. серной кислоты (тремя порциями), затем отмьтают водой, и органический раствор сушат над безводным сульфатом натрия. Этилаиетат частично упаривают (приблизительно до объ ема 150 мл). Оставшийся раствор прибавляют к раствору аминокомпонента в тетра- гидрофуране и смесь охлаждают на ледяной бане. К охлажденной смеси прибавляют при перемешивании и охлаждении льдом 11,3 г ДЦГКДИ и продолжают перемешивание в те чеяие 16 ч. Образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают, а фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток растворяют в 50 м этилацетата, раствор промывают 0,5 н. сер ной кислотой и 4%-кым водным раствором бикарбоната натрия. Отмытый этилацетатный слой сушат над безводным сульфатом натрия, затем упаривают досуха при пониженном давлении и к остатку добавляют петролейный эфир. Образовавшиеся кристаллы отлоляют фильт юванием, 11ерек)1исталлизо28вывают из смеси этилапетат/петролейный эфир. Выход продукта 21,9 г (87% от теоретического), Т.ПЛ. 55-57°C; ot3 -30,170, Найдено,%: С 61,61; Н 8,1О; N 8,18 . Вычислено,%: С 61,52; Н 8,14; N 8,28 Б. Синтез 2-Pfo-bft(BOt)-AEoi-OtBu В 4О мл метанола растворяют 2,5 г 2-Ly«,.CBOC)-AE0-OtBu и. используя палладиевую чернь в качестве катализатора, проводят в течение 2 ч каталитическое восстановление. Катализатор отфильтровывают а фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 2О мл этилацетата. К этому рмствору прибавляют 2,45 г ONb и смесь переме-; шивакэт при комнатной температуре в течение 18 ч. Полученный раствор разбавляют 20р мл этилацетата и промывают вначале 0.5 н. серной кислотой, затем 4%-Hbnv водным раствором бикарбоната натрия. После трехкратной промывки водой органический раствор сушат над безводным сульфатом натрия и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток обрабатьтают петролейным эфиром, осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси этилацетат/петролейный эфир. Выход продукта 2,53 г (85% от теоретического)j Т.ПЛ. 127-129°С;Ы т, -64,52«1с 1,04. метанол). Найдено,%: С 61.81; Н 8,31, N 9,37 В.в°«% Вычислено,%: С 61,57;1Н 8,ООг N 9,27 С. Синтез 2-ThP-LvsCBOC)-Aea-OtBu. 2,12 г 2 Pro-UbCBQC Aea-OtBu в 40 мл метанола гидрируют в течение 34 над палладневой чернью. Катализатор отфильтровьтают, а растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 2О мл диоксана. Параллельно 977мг Z-Tlnr-OHи 806 мг НО N В растворяют в 1О мл смеси этилацетат/диоксан (1:1) и при охлаждении на ледяной бане прибавляют 800 г ДЦГКДИ. Реакционную смесь перемешивают в течение 6 ч, образовавшуюся ДЦГМ отфильтровьюают и фильтрат прибавляют к приготовленному по описанной методике диоксановому раствору .аминокомпонента. Реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч растворитель отгоняют при пониженном давлении и остаток растворяют в 150мл этилацетата. Раствор промывают 0,5 н. серной кислотой, 4%-ным водным раствором бикарбоната натрия и, наконец, водой, органический слой сушат над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток обрабатьтают петролейныгуГ эфиром, выпавший осадок отфипьтровьгеают. Выход продукта 2,3 г (93% от теоретического), т.пл. 64-б7 С; , -75,58 (с 0,995%; метанол). Найдено,%: С 59,25;Н 7,99; К 9,65 «..ю. Вычислено,%: С 59,55; Н 7,85, N 9,92 Д. Синтез Z- ph« - Phe - Туг - Thr - -Pro-Lvs (BOG) -Afa -CtBtt. 1,41 г Z-Thr-Pro-L(bCbOC)-AEcii-(HBu, растворенные в 7O мл метанола, гидрируют над палладиевой чернью в течение 2 ч. Катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают при поннженном да лении. Остаток растворяют в 1О мл ДМФ и к раствору прибавляют 1,1 г 2 PVie-Ph -ТУГ-ОН и 72О MrHONB. Затем при охлаждении на ледяной бане к раствору пр бавляют 618 мг ДЦГКДИ и реакционную смесь перемешивают в течение 20 ч. После этого растворитель отгоняют при пониженном давлении, остаток обрабатывают смесью этил/ацетат/эфир (1:1). Образовавшееся при этом порошкообразное водест во отфильтровьгоают и перекристаллизовывают из этанола. Выход продукта 2,1 г (10О% от теоретического), т.пл. 16О 163, -63,73° (с 1.О5%, ме танол). Найдено,%: С 62,О2; Н 7,14 Ы 9,64 «VOibNe Вычислено,%: С 62.09 Н 7,23; N 9,34 ЕГ Синтез Z - Дг§ CHOg) - Gty - Phe -РЬе - Туг -Thr- ft-o - LVS (BOO)- Ata-OtBu 2,32 г Z-Phe-Phe-T5 r-Thr-T ro-lv$ CBOO-ACa-Otbu, растворенные в Л 30 мл метанола, гидрируют над палладневой черные в течение 3 ч. Катализатор отфильтровывают и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 5 мл ДМФ и к полученному раствору прибавляют 1,26 г (НОг V C E-s-ON. Реакционную смесь перемешивают при ком- натной температуре в течение 2О ч, псхзле чего ДМФ отгоняют при пониженном давлении и остаток обрабатывают 5О мл воды. Выпавший осадок отфильтровьтают, дважды переосаждают из смеси ДМФ/вода. Выход продукта 2,5 г 188% от теоретического); т.пл. 138-141- С (разложение), ,4 (с 0,99%; ДМФ). Найдено,%: С 58,82,Н 6,8О, N13,66 Вычислено,%: С 59,14; Н 6,81; N 13,8О Ж. Получение -Ala - Arg -QLy-РЬеРле-Typ-Thf -Pfo-Lys-А.(а-ОН. В 30 мл смеси метанола и ледяной уксусной кислоты (2:1) растворяют 71О мг Г- Ahg-CNOjV G,Es-Ptie- he-Tvr-Thh-Pro- U-ss свое VAEbi-OtBu и в присутствии палладиевой черни восстанавливают в течение 8 ч. Катализатор отфильтровьюают, фильтрат упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток растворяют в 10 мл воды и раствор irpo- пускают через хроматографическую колонку (объем 13О мл), заполненную карбоксиметилцеллюлозой. Элюцию осуществляют градиентным методом с использованием О,О05 М водного раствора апетата aNJMO- ния (800 мл) и 0,2 М водного раствора ацетата аммония (8ОО мп). Фракпни от 913 и до 119О мл объединяют и лиофялнзуют. Получают 35О мг белого пушистого продукта, который растворяют в 8 мл ДМФ, к раствору прибавляют 41 г моногидрата П- -толуолсульфокислоты, затем туда же 82 мг БОС- (5 - АВся -ONB, и реакционную смесь перемешивают в течение 16 ч. ДМФ отгоняют при пониженном давлении и к остатку прибавляют 3 мл трифторуксусной кислоты. Смесь перемешивают в течение ЗО мин, трифторуксусную кислоту отгоняют в вакууме. Остаток раствсхряют в Ю мл воды, полученный раствор пропускают через колонку (1,Ох хЮсм) с Амберлитом JHA-41О (в ацетатной форме). При прохождении через колонку с этим анионнтом вещество превращается в ацетат. Элюат лиофилизуют и вводят в колонку (2,2 х 17 см), заполненную карбоксиметилцеллюлозой. Элйшпо осуществляют градиентным методом с использованием О,ОО5 М водного раствора ацетата аммония (5ОО мл) и 0,2 М водного раствора ацетата аммония (5О мл). Фракции от 430 до 5ОО мл объединяют и лнофнлизуют. В результате получают 250 мг белого пушистого видества с р1 ,8 (с 0,5%, воде). Аминокислотный анализ: Ь-ь/б 1,00; Afg 1,04; Thr 1,00; -рго 1,04; GC 1,О4; АЕа 1.04; 0,89; Phe 2,00; Й-АЕо 0,93 (содержание пептида 72%). П р и М е р 23. Получение Qe- -Arg- Ge i-Piie- 7e-T)r-Thr-pro-LNe.- Aed-OHВ1х;произведена методика приме ш 22, но вместо ВОС- |b-AEa-ONB используют ВОС- tjtv - ONB и получают 214 г упомянутого соединения в виде белого пушистого продукта; W -5.9,2 (с О,4%; вода). Аминокислотный анализ: Iys 1,02; Afg 1,00; Thr 1,00, i.oi; &ev 2,00; Ata 1,03; T;Jf O,87; fhe 2,04 (содержание пептида 78%). пример 24. Получение Lea - АР -Qty -Phe Phe -Tjp- aiy -NHg. A. Приготовление 2 - len - Arg (ToSJ - Pb« - Pht - Tyr (ВлО - fy - смсмы. В реахтор твердофазного пептидного сян тзА ( efwor ttlAPS ОО) псмещают 4,О4 г ВОС- 6tv -смолы (содержащей 1,75 ммоль QCy ) я оставляют набухать ее & хлористом метилене в тече яяв 20 ч. Затем по методу Меррвфидоа вводят вос Tjir-lBtex. ОН, вех:-. Phe-он, ВОС- The -ои, вое- &ev -он, Але -Al-irCroDUDH я Z - Leu JOH в ужезаяяом nopswKe. В качестве хощ1евсирук шегр агента применяют ДЦГКДИ, Каждую амняоккслоту берут в четырвяфатяом; избытке, ВОС-гру1шы удаляют с помощью тряфгоруксусной кислоты в двхлсфметане (1:1). Смолу навлекают из реактора, промывают дюЕЛОрметаном ДМф, метанолом и уксусвой вжслотой, сушат. Получают 5,07г смолы, Б. Првготовленве Z-ten - Arg (toS) 3fy-Phe-Phe-туг (ftzO-aiy - KHjj. В 50 мл 17%-ного раствс аммнака в метаноов помещают 4,41 г смолы, получевной по примеру А, сусЛевзЕПО :пфемешнваю в закрытом сосудСпри.аоктайтной температ е в течение. 48 ч,. Смолу отфильтро вывают н хорошо промывают ДМФ. Фильтрат в промывные воды объединяют н упарнвают при пониженном давлен. К маслянистому остатку, добавляют этиловый эфир вьшавший осадок отфильтровывают и промывают эфиром. Выход 950 мг. В. Приготовление Leu- A gfQ v-Phe-Phe-Tyr -UE:s- NN2Б lO мл безводного фтористого водорода растворшот 5ОО мг сырого защищенного пептид-амида, полученного по примеру Б, в 0,5 мл аниаола, раствор охлаждают до ОЧи и перемешивают в течение 60 мин Фтористый водород отгоняют, остаток растворяют в 50 мл воды. Раствор дважды экстрагируют 20 мл этилового эфира, водный слой пропускают через колонку(2x10 с Амберлитом JRA -41О (в ацетатной форме) и лиофилнзуют. Продукт помещают в колонку (2,3 X 17 см), заполненную кар оксиметилцеллюлозой, н вымывают путем градиентного элюирования 0,005 М водным ацетатом аммония (40О мл), затем 0,2 М водным ацетатом аммония (400 мл Фракции 49О до 550 мл объединяют и лиофнлизируют. Получают 167 мг указанного сЪедннёнияв виде белого пушистого продукта. Аминокислотный анализ: , 57 5 2,00; Leu 1,03; 0,89; Phe 2,06 (содержание пептида 84%). jB Afo- П p и м e p 25. Получение -Arg-aty-Phe-Pbe-Tyr-Ala-Gfy-KH A.Приготовление Z- -Ala -Arg(ToS) Qfy-Pbe-Phe-Tyr(Bzt)-Afa-Gty -смолы. В реактор синтеза (Simadto APS-SOO) помещают 3,03 г ВОС- 6 -смолы (содержание 8V( 1,32 мм), и оставляют набухать в хлористом метилене. Затем с помсицыо симметричного ангидридного процесса вводят ВОС- Ас01 ОН, BOC-T-iJp ЬтЮ-он, ВОС- РЬе -ОН, ВОС- Ph -он. ВОС- (Jfy -он, Аос .-Ai g-{ToS)-OH и во -ОН в указанном порядке На каждой стадии ВОС-вопиту удаляют с помошью 5О%-вой смеси трйфтс уксусная кислота/дяхлормётан. Кроме того, на каждой стадии негрореагировавшие аминогруппы адетишфуют ангидридом уксусной кислоты. После введения в реакцию всех аминокислот смолу промьгоают этанолом, ДМФ, дихлорметаном, уксусной Кислотой и метанолом, сушат при пониженном давлении. Получают 3,7О г пептидной смолы. Б. Приготовление Z-/ -ЛЬ-Arg (ТЪЗ) Gfy-Phe -Ph€-TVpCBzO-Ato- Gfy -NH. В 3,28 г пептидной смолы, полученной по методу А, суспендируют в 5О мл 17%ного аммиака в метаноле, в плотно закрытой склянке, суспензию перемешивают при комнатной температуре в течаше 4О ч. Смолу отфильтровывгиот и промывают 5О мл ДМФ. Фильтрат и промывные воды объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении. К остатку добавляют эфир, выпавший осадок отфильтровывают, сушат, получают 433 мг сырого защищенного пептид-амида. B.Приготовление |i-ACc3i7 Argr-Ge -Phe-Phe-T r-Atq-G-ev-NHj. Б смеси из 8 мл безводного фтористого водорода и 0,3 мл анизола .растворяют; 310 мг сырого защищенного пептнд-агкгида, полученного по методу Б, раствор перемешивают при 0°С в течение 60 мин.. Фтористый водород отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 50 мл воды. Раствор дважды экстрагируют 10МП эфира. Водный слой отделяют и наносят на КОЛОНК.У (1 X 10 см) с Амберлитом JRA-410 (в ацетатной форме), которую затем промывают водой. Вытекающий поток и промывные воды объединяют и лиофилизи уют, сухой продукт растворяют в 1О мл воды и наносят ва колонку (2,3 X 17 см) с карбоксиметилиеляюлозой. Градиентное элюирование выполняют 0,005 и 0,2 М водными растворами аяетата aMMoujfsr MOO мл каждый) ,ФракНИН от 495 до 54О мл объединяют и лиофипизируют. Получают 134 мг у1сазаннаго продукта; {ck.} -19,62 (с 0,53%, вода). Аминокислотн й анапиз: Alfg 1,О5; 5 1,95; АЕа i,oo; о,86, РЬе 1,98-, |Ъ - АСся 1,02 (пептидное содержание 84%). Найдено,%:С 52,4О; Н 6,55; N 15,65 Вычислено, %:С 52,31; Н 6,91, Н 15,5 Пример 26„ Получе {ие ct v -Dafe - - АР§ -( -РЬе -Phe -Ala -GFv - NHg. Воспроизведена методика 25 за исключением того, что вместо 2 | Atoi-OH введена ди- I - d.., г Attu-ОН -аминокислота. Получено указанное соединение в виде белого пушистого продукта; oL . -2О,3% (с 0,2%; вода). Аминокислотный анализ: ,00, GEv 1,89; ABoi 1,02; Jyf- 0,88, Phe 2,ОО; :i,y-Abu 1,04 (содержание пептида 81,5%) Пример27. Получение G|Es-Alg -de -Phe-Phe-NH, А. Приготовление Z - (aty-Ai-g-CNO -Cigv - he-Phe- NH. К о,во г Г-Аъ -СМО - -СчЕ-а-РЬе-РЬеНН 2 добавляют 8 мл 25%-ной Htib-уксусной кислоты, смесь хорошо взбалты- вают при комнатной температуре в течешге 45 мин. В реакционную смесь добавляют 1ОО мл эфира, полученный порошок отфильт ровывают высушивают в течение 2-х дней над гранулами гидроокиси натрия в эксикаторе при пониженном давлении. Высушенный продукт растворяют в Ю мл ДМФ, раствор нейтрализуют триэтиламином. В раствор добавляют 0,43 г Z- СзС)- ONB, смесь перемешивают в течение 1О ч, затем добавляют 7 мл воды и отделяют масло. После удаления супернатанта декантацией добавляют 50 мл воды. Выпавидий осадок отфильтровывают, высушивают и чистят переосаждением из смеси /3 Ф/этилацетат. Выход продукта 0,66 г (77% от теоретического); т.пл. 119-122°С; о1 -24,6°. (с 1,О1%;ДМ Найдено,%: С 55,95; К 5,90; N 17,73 Вычислено,%: С 55,51; Н 5,95; N 17,99 Б. Приготовление - A g -GfK -Phe-Phe-NW,. 5OO мг Z-Ge -Ar gCN02)-йe -Phe--Phe-НН 2 Растворяют в 30 мл ук- сусной кислоты и восстанавливают над палладиевой чернью в течение 7 ч. Катализатор отфильтровывают, уксусную кислоту отгоняют при пoню«eннJ . Остаток растворяют в 1О мл вэды и раствор пропус 5 5 кают через колонку (1,8x10 см) с карбоксигметилцеллюлозой. Элюирование выполняют методом лкнейкого градиента, используя 0,1 М водный раствор ацетата аммония (7ОО мл) и 1 М : Водный раствор ацетата акгмония (7ОО мл). Фракции от 41О до 515 мл объединяют и ЛИОФИЛИ31ФУЮТ. Получают ЗО7мг (65%) белого пушистого продукта. oL,, 17,7° (с 0,48%, вода). Аминокислотный анализ (гидролиз сНСВУ Pg-lД5; GZ-4 2,00;Phe 2,00 (содержание пептида 84,0%). Найдено,%:С 52,05; 11 6,85; N 17,22 С,Нз,,.2С,,-2Н,0 Вычислено,%: С 52,О9;Н 6,97. N 17,О9 Пример 28. Пэлучонпе 15-АЕа-Arg-G,6-j-Phe -Phe-NH.,. А. Приготовление Z-D-ACoi-Аг (NDjlQe -Phe -Phe-HHj. В 8 мл 25%-ной HBv -уксусной кислоты растворяют 0,8О г ( МО -СтР РЬе-РЬе-NH, , раствор поромоипшпют при комнатной температуре в течокте ГО мин. Продукт осаждают, добавиг к г , HlOMn этилового эф1фа, осадок отфильтрэвьгвают, промьщают эфиром и . Сухой продукт растворяют в 10 мл ДМФ, раствор нейтрализуют триэтнламинэм, после чегэ бавляют 0,51 г Z-D-Aec(- ONB- Смос.ь перемешивают в течение 8 ч. отгоняют при пониженном дав/юнн1, к гютатку добавляют 50 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывают, После высушивания, порэшэк промт.шают горячим этилацетатом н переэсажлают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 0,799 г (92% от теоретического); т.пл. 223-225 0; oL -22,3° (с 0,98%, ДМФ). N 17,98 Найдено,%: С 56,38, Н 6,07, Вычислено%: С 56,69; Н 6,04; N 17,87 В. Приготовление D-Ata - A gr-ue -ptie-Phe-HH5. 6OO мгс Z-D-Aea-ArgrtNOjVC,ei-Phe-Phe-HH, растворяют в 30 мл уксусной кислоты и восстанавливают в присутствии палладиевой черни в течение 7 ч. Ката1шзатор отфильтровывают, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 1О мл воды и раствор пропускают через колонку (1,8x11 см) с арбоксиметилсефадексом. Линейно-градиентное элюирование выполняют 0,1 М водным раствором ацетата аммония (700 мл) и 1 М водным раствором ацетата аммония (700 мл). Указанное соединение выходит во фракциях от 35()
35 до 450 мл. Эти фракции объединяют и лиофилиэйруют. Выход 400 мг (73%) белого пушистого продукта; -22,2 1с 0,51%: вода). Аминокислотный анализ: Агр1,01 QBv 1,ОЗ; АЕо 1,ОО; Phe 1,99 (содержание пептида 82,3%). Наййево.%: С 52,66; Н 6,92; |4 16,82 аЛ10 -2 г«Л-2НаО Вычислено,%: С 52,72;Н7,11; N16,77 П р я м е р 29, Получение Phe- A g--S,es -Phe-Phe-NH,j. А. Приготовление Z-Phe-At gг(NO,-Qey. Phe-PVie-NHaВ 1О мл 25%-ной HBf -уксусной кислоты растворяют 8ОО мг Z AVg()- (qES-Phe-Phe-HHjpacTBOp перемешивают в течение 50 мин, К раствору добавляют 80 мл эфира, выпавший осадок отфильтровьшают, сушат и растворяют в 10 мл ДМФ Раствор нейтрализуют триэтиламином, затем добавляют 7ОО мг1 2 - Phe -ОРСР (дентахлорфениповый эфнр). Смесь перемеш вают в течение 10 ч, добавляют 50 мл 1 М водного аммиака. Маслянистый слой отделяют декантацией и туда добавляют воду. Полученный порошок отфильтровывают i сушат. Смешивают продукт с 5О мл этил- адетата, смесь подогревают, порошок отделяют фильтрованием в.горячем состоянии и чистят переосаждением из смеси ДМФ/этил адетат. Выход продукта {8О5 мг (92% от теоретического); -29,0 tc 1,0%, ДМФ). : Найдено,%:С 6О,32; Н 6,О2: N 16,1О C4.o09V42H,0 Вычислено,%: С 60,Об; Н 5,98, N 16,2 В, Приготовлешш Phe-A№-Gey Phe- he-NH2, в 6 мл безводного фтористого водорода растворяют 500 мг Z Phe-ArgCNO )-GC -Phfi-Phe-NHgH раствор перемешивают при «Ю и течение 40 мин. Фтористый водород отгоняют, а остаток растворяют в 1О мл воды. Раствор пропускают через ко лонку (0,9 X 15 см) с AM6epnHTOMjRA-41 (в ацетатной форме), который предваритель но промыт водой. Вытекающий поток (эф люент) объединяют с промывными водами смешанный раствор лиофнлизнруют. Получают Ю2 мг указанного соединения. Аминокислотный анализ: Afgf 1,01; G6 0,98; PVie 2,94, (содержание пептида 86,2%). Пример 30, Получение Leu- Argp -b-ev-Phe-Phe-lyr-NHj.
36 A,Приготовление Z-Arg-(NO )Сче: - Ье-РНё-Туг-NH. В 1ОО мл ДМФ растворяют 12,2 г Z-Phe-Phe-Tsf- NM,.гидрируют присутствии палладиевой черни в течение 5 ч, Кататгазатор отфильтровывают и добавляют 8,6 г -Ahp-(.NO2)-(3E)-OH Н 1,3г HONB. Реакционную массу охлаждают льдом и добавляют 4,95 г ДЦГКДИ. Смесь перемешивают в течение 12 ч. Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, в фильтрат добавляют 1 л воды. Полученный гелеобразный осадок отфильтровывают и переосаждают из метанола и воды. Выход продукта 16,25 г (91,8% от теоретического); т,пл, 181-1840C;tdl L -16,00 (с l,0t%; ДМФ). Найдено,%: С 58,02;Н 5,98,- N 15,66 С4Ло°1с 1с-«2 Вычислено,%: С 58,35; Н 5,92; N 15,83 Б. Приготовление Ahcr-gCj-phe-Phe-TVh-NH,. 600 мг Z-AY-g-CNOp-sey-Phe-Phe Tvr- NHj pacTBOpJODT в 30 мл уксусной кислоты, гидрируют Б присутствии палладиевой черни в течение 9 ч. Катализатор отфильтровьгоают, растворитель схггоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 15 мл воды и чистят, пропуская че(эез колонку (1,3 х 11 см) с карбоксиметилсефадоксом. Линейно-градиентное алюированне вьшолняют 6,1 М вoдньпvt раствором адетата аммония (50О мл) и 1 М водным раствором ацетата аммония (5ОО мл). Фракции от 25О до 42О мл объединяют и лиофилизирутат. Выход продукта 416 мг ( 72,5% от теоретического); -7,6° (с 0,4%, вода). Найдено,%: С 55,81; Н 6,83; N 14,78 Вычислен1),%: С 55,37; Н 7,03) N 14,90 Аминокислотный анализ: ,02; G-E:# 1,00; ТУИ O,9i; Phe 2,02 (содержание пептида 82,5%), B.Приготовление 2-Leu - Аг N О)-CiE-x-Phe-Phe -r-if- NH К 700 мг. I-Arg-(NO.jVG,ev-Phe-Phe-Tyi NH 2 добавляют 0,2 мл анизола, 7 мл 25%-ной НВ -уксусной кислоты. Смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 4О мин, затем добавляют 10О мл этилового эфира. Выпавший осадок отфильтровывают, сушат и растворяют в 1О мл ДМФ. Раствор нейтрализуют триэтнламином и добавляют к нему 344 мг .2 - -Leu - OSu. ( N -оксисукцинимидный эфир). Смесь перемешивают в течение 12 ч, ДМФ
37
отгоняют при пониженном давлении, к остатку добавляют 50 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывают, чистят переосаж- дением иэ метанола и воды. Вьгход продукта 56О мг (70,9% от теоретического); Т.ПП. 193-1950С, ,90 (с 1,13%, ДМФ).
Найдено,%: С 58,72; Н 6,22, N 15,36
с49Мм0.п ,;н,о
Вычислено : С 58,96; Н 6,36; N 15,44
Г. Приготовление LfiU - A gr-Q-fiv - Phe-Phe-Tyr-NH,,.
В 30 мл уксусной кислоты pacTBOpssTOT 4ОО мг Z-Leu-Ar-g-CNO VGEv-Phe-PheTiJi НЯ,восстанавливают в присутствии палладиевой черни в течение 1О ч. Катализатор отфильтровывают, растворитель отгоняют при пониженном давлении. Остаток растворяют в 5 мл воды и чистят, пропуская раствор через колонку (2,6 х 22 см) с карбоксиметнлцеллвзлоаой,
Градиентное элюирование вьшолняют 0,005 М водным раствором ацетата аммония (ТОО мл) и 0,2 М водным раствором ацетата аммония (70О мл). Фракции от 83О до 91О мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 217 мг ( 55,5% от теоретического); -14,9° (с 0,47%, вода).
Найдено,%:С 55,.71,Н 7,12, Н 14.81
. Вычислено,%: С 55,43; Н 7.24; N 14,37 Аминокислотный анализ: Afg 1,03;йЕу
1,оо; Leu 1,00; Phe 2,00; о,85
(содержание пептида 78,О%),
ПримерЗ. Получение cL AbuA EГ -(JE-a- Не PhS T r-NHjВоспроизведена методика примера ЗО, за исключением того, что вместо 2 Leu используют и получают указанное соединение, о- т) -13,6° (с 0,32%; вода).
Аминокислотный анализ: Argl,O2; QP
о,9«; oC-Abui,O4; Phe 2,00; Туг о,92
(содержание пептида 81%).
П р и М е р 32. Получение Nle-Afg--Qev -Phe-Phe-Tyr-NH,.
Повторена методика примера 30 за исключением того, что вместо Z используют Z NE6 и получают указанное соединение; Г° -14,3° (с О,4%;вода)
Аминокислотный анализ: Argrl.OO; Q6j/ 0,97; 1,04; Phe 2,ОЗГ ТугП,91 (содержание пептида 849о).
Пример 33. Получение Vag-Afg--G,6v-Phe-T Vie-Tvr-NH,.
В KD мл ДМФ растворяют 4ОО мг Ar -&6 - rie-Phe-Tyr- HHj, диацетата. полученного по примеру 30 Б, добавляют
38
ЗОО мг Z-V6)C.-ONB . Раствор иейтраяшзуют триэтиламином а перемешивают в течение 10 ч, затем к неглу добавляют 50 мл эфира и выпавший осадок отделяют фильтрованием, промывают зтг-илацетатом и сушат. Этот- продукт растворяют в 30 мл смеси уксусная кислота/вода (1:1) и восстанавяивают в присутствий палладневой черни в течение 4 ч. Катализатор отфильт- роБывают и фйпьтрат концентрпру1К т досуха. Остаток растворяют в 10 мл воды и чистят с помощью хроматогоаЛши так же, как, в примере 30 В. Выход продукта 360 мгг ,7° (с 0,5%; вода). Аминокислотный анализ; ,02, GrCv 1,00; 0,97; Phe 2,04;. 0.97 (пептидное содержание 86,2%) ,
Пример 34, Получеш1е - Q -Qe -Phe-TPhe-NHj.А. Получение Z-A g-CNOj -Q-tv-OEt. . 70,7 г Z-Arg- NO,)-QH растворяют в 2ОО мл тетрагидрофурана и, охлаждая на бане со льдом, добавляют 4О,5г 2,4-динитрофенола и 45,4 г ДСС. Смесь
перемешивают 4 ч. Параллельно с STIIM
30.7г 0(6: -OEtHCEсуспендируют в 2ОО мл тетрагидрофурана и, охлаждая на бане со льдом, суслеыэню нейтрапизуют
30.8мл триэтиламина. Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, к фз льтрату д бавляют раствор активированного , полученного по описанной методике, смесь перемешивают в течение ночи. Раствор концентрируют и остаток растворяют в 500 мл
этилацетата. Раствор промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (2ОО млхЗ), 1 Н, соляной кислотой (200 мл X 3) и насыщенныл{ водным раствором хлористого натрия (2ОО мл х 3),
(хосле чего сушат над сульфатом натрия. Раствор концентрируют н кристаллизуют из системы этилапетат/петролей- ный эфир. Кристаллы отфильтровывают, перекристаллизовьшают из системы этнлацетат/петролейный эфир. Выход продукта 7О,О г (79,8% от теоретического); т.пл. ЮЭ-ИО С; -3,4° (с 1%; ДМФ). Найдено,%: С 49,26; Н 5,79; N 18,55
С,аНгеО,М,.
Вычислено,%: С 49,31; Н 5,98f N 19,17 Б. Получение 2-Arg- NQp-GEy-OH20,0 г Z-ArgrCNOp.-qev-OEt суспендируют в 1ОО мл ацетона н, охлаждая на бане со льдом, добавляют 64 мл 1 н. водного раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают 2 ч. при комнатной температуре.
После нейтрализации избытка щелочи соляной кислотой раствор упаривают 1фи riOHU- жвтюг яшшет-нгй н ж остатку доёавлягот 100 мя воды, Нерастворетошпйся осадсж отфняыровьшают Фнльграт подкислйют солаяой кт;пото1 и выпадающие кристаллы от деетзот г|:я.Нэтроза1шем, Выход продукта 18, {93,7% от теоретического), т,пя, 105°С; dli ,9С (с 0,9%; ДМФ). НайдекоДг С 44,48; Н 5,35, N 19,53 Л. ВычксленоД: С 44,86J Н 5,65; N 19,6 С. Получеете (NOд)-Ges- h€-Phe-NH,, 3,91 г Х-РЬе-РНе-NH растворшот а 60, мл ДМФ и 40 мл метаиола н восстанавливают э присутствии палларлевой черш в течение 14ч. .Каташгзатор отфильтровывают, а растворитель упа ривают при пониженном.давлений. Остаток растворшот в ЗО мл ДМФ, Параллельно с зт-им 6,80 г Z-Arg-CNOp-Ggu-OH вводят в SO мл тетрагндрофурана и, охлагкдая смесь на бане со льдом, добавляют 3,23 HONB и 3,71 г ДЦГКДИ. Полученную сме перемешившот в течение 5 ч. Обраэовавшутйзсй ДЦГМ отфшгьтровьтагот и к фильтрату добавляют получешгый аминокомпонент (H-Phe-Phe-NHj ). Смесь оставл1гют на пйчь при постоянном перемешиваши. После упариваиня раствс-рятелз при пошзжегшом давлении к остатку добавляют iOO мл воды, н образующееся при этом твердое r OpoitiKoo6pa3JiDS вещества отделяют фильтроваккеМоПорошок, собранный на фильтре, высушивают, промывают зтндацетатом и пере- кристалгчгюовьюают из смеси этанол/этил/ /апегат. Выход продукта 8,34 г (72,7% от теоретического), т,пл. 112-113 С; Ы1|.21,60 (с 1%-, ДМФ). Найдеао,%; С 56,75,Н 5,72: N 1Т,4О -5AiW«20 Вы«аслеио,%;.:С 56,58: Н 6,01, N 17,4 Д. Получение - 2 - /Ъ - - . 3,35 г Z p A-eq-OH а 3,23 г HONB {застворягот В 4О 1Л тетрагадро фурана н иоеде охдаждениа смеси на бане со льдом добавняют 3,71 г ДЦГКДИ. Смес оставяя1« г аа ночь кфп постокшсем аереме шнэаннн н образовавшуюся ДЦГМ отфипь TpOBbmajOT, Растворите1гь упаривают прн пошскенном давлении и к остатку добав Л51ЮТ пиробензол. Образовавшиеся кристаллы, отфипьтровьшают и перекристал/шзовывают на апетошггрила. Выход продукта 3,83 г (66,4% от теоретического); тлл. 125-1260с, Найдеыо,%: С 62,52; Н 5,18t N 7,29 6 Вьппгслено,%: С 62,49: Н 5,24; N 7,29 Е. Получение Z-f% АЕа - Afgi (NOjV Qe Phe-Phe-NHj. К 1,06 г Z-Afpr(NO,l-Gev-PReРhe-NH добавляют 1О мл раст ора HBt в уксусной кислоте, смесь встряивают при комнатной темп эатуре в течеие 4О мин, после чего добавл5пот диэтновый эфир, Вьшадавигай осадок отделяют эшьтрованием, высушивают при пониженном авлении в эксикаторе над гидроокисью иа рия и растворяют в 10 мл ДМФ. После хлаждения раствор нейтрализуют 0,84 мл рнэтиламина н добавляют 0,69 г t- Afa-ONB . Смесь оставляют на ночь ри постоянном перемешивании, затем растсфитель упарнвают при пониженном давлении и к остатку добавляют 5О мл воды. Осадок отфильтровывают, сушат, промывают этнлацетатом и переосаждают из смеси вода/диэксан/этилацетат. Выход продукта 0,98 г (83,3% от теоретического)t т.ш1. 161-163°С; Ы -20,90 (с 0,9%Г ДМФ). Найдено,%: С 56,84; Н 5,88; Ы 17,5О 1/2Н20 Вычислено,%: С 56,69; Н 6,О4; N 17,89 Ж, Получение - Argr-GC:y - Phe-Phe-NH. 8OO мг I-p.-AEa-Ar CNO VGCS-Phe-Phe-NHрастворяют в уксусной кислоты и восстанавливают над палладием в течение 14 ч, после чего катализатор отфильтровывают, а растворитель упаривают при пэниженном давлении. Остаток вносят в колонку (2,5 х 9 см), заполненную карбоксимотилсефадоксимом, и хро- матографируют, используя линейно-градиент- ную элюцию вэдньгчи растворами ацетата аммония: О,О1 и 1,0 н. (по 700 мл каждого раствора). Фракции от 780 до 990 мл объединяют а лиэ(|шлйзярук т. Выход продукта 5ОО мг (66% эт теоретического): ot -13,9° (с 0.5%: вода). Найдеио,%: С 53,75; Н 7,07, N 17,15 2С,,,,«4 0 Вычисленэ,%: С 54,ОО Н 7,01, N 17,18, Аминокислотный анализ: Atg 1,ОО (1), &ev 1,00 (1); Phe2,O (2) (величины в скобках соответствуют теоретическим значениям). Содержание пептида 76%. Пример 35. Получение у - Abu-Ar -Q -Phe - Phe-NHj. А. Получение Z - J - АЪи-ONU4,75 г Z-Jf-Atu-OH и 3,94 г HONB растворяют в 4О мл тетрагидрофурана и пэсле охлаждения на бане со льдом добавляют 4,54 г ДСС. Смесь перемешивают в течение 6 ч, образовавшуюся ДЦГМ отфипьтровьдаают. После этого растворитель упаривают при пониженном давлении, а к остатку добавляют 30 мл диэтилового эфира и затем небольшое количество воды. Выпадавшие кристаллы отделяют фильтрованием. Вы ход продукта 6,0 г (75,3% от теоретичес кого); т.пл. 66-69°С. Найдена,%: С 63,39, Н 5,42, N 7,О6 Вычислено,%: С 63,31 Н 5,57; «7,03 Б. Получение 1 - I -АЪи-Arg-( - Phe-Phe-NHj,0,53 г Z-At gtNOij-Gie-j-Phe-Phe-NHj обрабатьшаиуг раствором в уксусной кислоте аналогично гфимеру 34Е и растворяют в 15 мл ДМФ. После нейтрапизацЕИ раствора триэтиламином добавляют 0,44 г г-З -АЪи-ОМВ. Смесь оставляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении и добавляют воду. Образукяцееся твердое порошкообразное веществ отфильтровывают и высушивают. Затем про мывакуг этилацетатом и переосаждают иа смеси этанол/вода. Выход продукта 0,38г (65% от теоретического); т.пл. 167 17О°С с1 -21,2° (с 1,0%; ДМФ). Найдено,%:С 57,14; Н бДО; N17.56 Зв 48°П1о- 2Н.,0 Вычнслено,%: С 57,2О; Н 6,191 N17,56 С. Получение J-Abu Arg--G|E-s--Phe-Phe-NHj. ЗОО мг Z- -Abu-Ap ifiO ) ( -Phe-NHj растворяют в ЗО мл уксусной кислоты и в течение 6 ч гидрируют над над палладеим. Катализатор отфильтровывают, растворитель упаривают при пониженном давлении и остаток хромат01 афируют на карбоксимв гилсефадексе на колонке (1,8 х 10 см). Хро матографию проводят, используя линейноградиентную элюцию водными растворами ацетата аммония: О,О05 и 1,О н. (по 35О мл каждого раствора). Фракшш от 25О до 34О мл объедин51ют и лио(лиа руют. Выход продукта 18О мг (63% от теоретического) t el3 -15,0° (с 0,5%; вода). Найдено,%: С 53,93; Н 7,29Г N 16,34 ..-iyZH O Вычислено,%: С 53,95 Н 7,19, N 16,66 Аминокислотный анализ: Afffl,OO(l)l Gty 1,00(1); Phe 1,94 (2); содеркание пептида 76%. П р и м е р 36. Получение (f- AvaP-Afgr- -Phe- he-MHj. A, Получение - AVQ Е-Afg-( (0,)-Qe1 -Phё-Phe- NH,. 0,80 г )-G,e-s- he-Phet 2 обрабатывают раствором HBf 3 уксусной кислоте аналогично примеру 34 Ё, и растворяют в 10 мл ДМФ. Раствор нейтрализуют триэтиламином. Параллельно с этим О,ЗО г I-d-Avqf-OHH 0,24 г HONB растворяют в 5 мл тетрагидрофурана. 0,27 г ДЦГКДИ добавляют в реакционную смесь, охлаждаемую на бане со льдом, смесь перемешивают в теченне 3 ч ДиГМ отфильтровывают и фильтрат добавляют к аминококтоненту ( Н- -AvoC A p-{N0. )&,Phe-Phe-NH,, подучен-, ному по описанной методике. Смесь схггавляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при понкженном давлении и к остатку добавляют воду. Вьшавшее порошкоо азное вешеютво отделяют фильтрованием и высушивают. 3,чек его промывают этилацетвтом и переосаждают иэ смеси ДМФ/этилацетат. родукта 0,62 г (70% от теоретического); Л1Л. 154-157°С; dL i-13,00 (с 1,О. МФ). Найдено,%:С 57,84ГН 6.42; N16,80 С,,о09.о )Н2° Вычислено,%: С 57,69; Н 6,33; N 17,25 Б. Получение 5 - AwoiE - Arg--Qev-Phe -Phe-NHj.. 500мг z-Avafi-Ar-g-CNOj -GEif-Phe-Phe-NH растворяют . в 30 мл уксусной кислоты и гидрируют над палладием в течение 5 ч. Катализатор отфильтровывают а растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток хроматогра(|мруют : на карбоксиметчлсефадексе (колонка 1,8 х 9 см) элюоией в линейном градиенте водными растворами ацетата аммония ОД и 1,О н. (по 50О мл каждого раствора). Фракшш от 29О до 37О мл объединяют и яиофилизуют. Выход продукта 29О мг (61% от теоретического), ,60 (с 0,5%, вода). Найдено,%:С 54.34; Н 7,35; N 16.2О с,Л оЛ-2е,о.-з/2н,о Вычислено,%: С 54,53, Н 7,32Г 16,36 Аминокислотный анализ: Ar-g 1,11 (l) GCy 1,00 (1); Phe 2,04 (2); содерканйе пептида 81,4%. Пример 37. Получение - Acoip-APg--tie Phe-Phe-NH. . . А. Получение Z-г-Ac p-AfgrCNOp X(bPhe-| he-NH, 0,80 г - NH 2 об1 абатывают раствором HBif в уксусной кислоте по методика примера 34 tJ
43 и растворяют в 10 мл ДМФ. Гаствор нейтрализуют триэтиламином Параллельно с этим О,32 г Z - 6 -Лсар-ОН и 0,24 г НО MB растворяют в 5 мл тетрагидрофурач и добавляют 6,27 г ДСС при одновременном охлаждении смеси на бане со льдом. Смесь перемешивают в течение 3 ч. Образовавшуюся ДИГМ отфильтровьтают, фильт рат добавляют к аминокомпоненту { HAhg (NOj)-GCv-Phe-Phe- i,- полученном по описанной методике, и смесь сх:тавляют на ночь при постоянном перемешивании. Ра воритель отгоншот при пониженном давлени к остатку добавляют воду. Образузошееся твердое порошкообразное ветцество отделяю фильтрованием н тщательно высушивают. Затем его промывают этилацетатом и перекристаллизовывают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 0,49 г (55% от2 теоретического); т.пл. 102-104 43; cij-r, «20,0° (с 1,0%; ДМФ), Найдено,%: С 57,86; Н 6,40; N 16,76 а,.оО,М. ВычисленоД: С 57,697 Н б.ЗЗ: N 17.25 Б. Получение -Acdp-Arg--QCy - Phe Phe-NHj. 40O МГ Z- -Acap-At g CNO.-qevfPhe Phe-NHj pacTBOpsnoT в 30 мл уксусной кислоты и в течение 7 ч гидрируют по палладием. Катализатор отфильтровьгаают, а руастворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток наносят на колонку (1,8 X 10 см), заполненную карбоксиметил сефадексом, и хроматографируют линейноградие1ггной злюцией водными растворами ацетата аммония: О,1 и 1,0 н. (по 500м каждого раствора). Фракции от 250 до 330 мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 2ОО мг (51% от теоретичес кого); LoL -9,9° (с 0,6%; вода). Найдено,%: С 54,24; Н 7,26; N15,76 С,,2Н,0 Вычислено,%: С 54,46; Н 7,49, Kl5,8 Аминокислотный анализ: Ahg-l,OO (1)Г GtEv 0,98 (); Phe 2,00 (2); i -Асар (не огфеделялиУ, содержание пептида 79%. Пример 38, Получение Lv6- Af g -QN-Phe-Phe-HH. , . A, Получение ди- 2-L.a-Afp ( NO )-QCv-Phe-Phe-NHj, 0,8O г 2-Ar-g-CNOp-QE -Phe-PheNV j обрабатывают раствором HBf в уксусной кислоте по методике, примера34С а затем растворяют в 1О мл ДJЧФ. Раствор нейтрализуют триэтиламином. Параллельно с этим 0,54 г ди-2-Lvb-O л 0,26 г HON В растворяют в 5 мл тетрагидрофурана и добавляют O,v3O гДЦГКДИ,
44 охлаждая смесь в бане со льдом. Смесь перемешивают в течение 4 ч, образовавшийся осадок ДЦГМ отфильтровывают, а фильтрат добавляют к аминокампоненту (Н-Arg-(N02)- QEv-Phe-Phfi - NH), полученному по описа1-шой методике. Смесь оставляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении, а к остатку добавляют воду. Образовавшееся твердое порошкообразное вещество отделяют фильтрованием и тщательно высушивают. Затем вешеетво промывают этилацетатом и переосаткдают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 0,82 г (77% от теоретического); т.пл. 2ОО-2О40С (разложение); ,5° (с 1,1%, ДМФ), Найдено,%: С 59,04,-Н 6,13; N15,78 .. Вычислено,%: С 59,О6; Н 6,20; N 15,79 В. Получение L s-Arg -GEv-Р Ье-Plie-NN26ОО мг ди-j:-Ljs-Arg-()-Ge -Phe-Phe-NW2 растворяют в ЗО мл уксусной кислоты и в течение 6 ч проводят каталитическое восстановление над палладием. Катализатор отфильтровьгеают, а растворитель упаривают при поннже{шом давлении. Остаток вносят в колонку (1,5 х 11 .см, заполненную карбоксиметилсефадексом, и хроматографируют, используя лкнейноч радиентную элюцию водными растворами ацетата аммония: 0,1 и 1,0 н, (по 7ОО мл каждого раствора). Фракции от 65О до 76О мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 28О мг (52% от теоретического); d,p -4,3 (с 0,5%; вода). Найдено,%: С 52,64; Н 7,38; N16,42 32 вО М1оЗ гН4°г-2Н,0 Вычислено,%: С 52,52; Н 7,42; N 16,12 Аминокислотный анализ: ,O6, 11); Ly 1,09 (1); es 1,00 (i); PTte 1,97 (2)т содержание пептида 73%. Приме р 39, Получение сА.,у--ро1 tj -Arg--Qev-T)he-phe-NH.j. , А. Получение ди- г-БаЪ (NO2) -G(ey-phe-Phe t4H О,8О г Z:-Ar-|r(NO2)-G,e-a-Phe-Phe-NH2 обрабатьтают раствором НВГ в уксусной кислоте по методике, описанной в примере 34 Е, и растворяют в Ю мл ДМФ, после чего раствор нейтрализуют триэтиламином. Параллельно с этим 0,50 г ди- Z ct,y -Вс(Ъ-ОН и 0,26 г HONB растворяют в 5 мл тетрагидрофурана и добавляют 0,ЗО г ДЦГКДИ при одновременном охлаждении смеси в бане со льдом. Смесь перемешивают в течение 4 ч, и образовавшуюся ДЦГМ удал5пот фильтрованием.
45 Фильтрат добавляют к полученному амии компоненту Н- Arg-( C|E Р tie- РЬе - и смесь оставляют на ночь при п стаяниом перемешивании. Р астворитель yita ривают при пониженном давлении, а к остатку добавляют воду. Выпавший осадок от филыровывают н тщательно высушивают. З тем его промывают этилацетатом и переосаждакуг на смеси ДА Ф/этилацетат. Выхо пгродукта 0,82 г (78% от теоретического) Т.ПЛ. 184-1880С; -19,5° (с 1,1%; ДМФ). Найдено,%: С 57,95-, Н 5,9Г, Н 16,19 4U JfOilNfi 2 Вычислено,%:С 57,79, Н 6,О1; N 16,21 Б. Получение , I - Dab - Atg--Qgv-Phe- Phe- NH, 6OO МГ «и- I-oL.r-Bcsb-AfgrCMO)GEv-Phe-Pbe-NH растворяют в ЗО мл уксусной кислоты и в течение 6 ч прово- дят каталитическое восстановление над палладием. Катализатор отфильтровывают, а растворитель упаривают при пониженном дае лении. Остаток наносят на колонку {1,5 х 13 см заполненную карбоксиметилсефадексом, и хроматографируют, используя линейно-гра- диентну(р элюцию водными растворами ацетата аммония, О,1 и 1,О н. (по 70О мл каждого раствора). Фракции от 610 до 680 мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 255 мг (46% от теоретического) . -12,5 (с 0,8%; вода). Найдено,%: С 50,59, Н 7,61; N16,93 Вычислено,%; С 5О,34;Н 7,28; Н Л,31 Аминокислотный анализ: AVP1,00 (l), Ge-j 1,00(1): РНе i,98 (2Г, oi,f -Т5о4Ъ 1,О2 (1), содержание пеятида 72% Пример 4О. Получение Argr-Qe -Phe--phe-NH.j. А. Получение Z-Ahg lNO I - A gгCN02V -G,e -Plie -Pha - NM. O,8O г Z-At-g-CNO -GC -Pbe-pheобрабатывают раствором НВТ в уксусной кислоте по методике примера 34 Е, и осадок растворяют в 1О мл ДМФ. Раствор нейтрализуют триэтиламином. Параллельно с этим 0,39 г Z-Afgr( и 0,22 г 2,4-динитрофенола растворяют в 5 мл тетрагидрофурана и добавляют 0,25 г ДСС при одновременном охлаждении смеси на бане со льдом. Смесь перемешивают в течение 2 ч и отфильтровывают образовавшуюся ДЦГМ. Фильтрат добавляют к полу- ченному аминокомпоненту N0) Gft -Phe-Phe-NVUH оставляют смесь на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении, а к остатку добавляют вопу. Мислообраз40ный пр;1дукт тщательно пpo ывaкyг водой и переосаждают из смеси ДААФ/зтилацетат. Выход продукта 0,90 г (80% - теоретического)-, Т.ПЛ. 89-92°С; , (с 1 ,О%,- ДМФ). Найпено,%: С52,2О,Н 6,10-. Н2П,Г)1 .14Вычислено,%: С 52,О5; Н 5,ПО; К 21,25 Б. Получение Arg-- he -Phe-NH,, 700 мг Z-Arg-CNQjT-A g-t NO VBC -Phe-Phe- NH растворяют в 4O мл уксусной кислоты и в течение 9 ч проводят каталитическое всхгстаиовленне над палладием. Катализатор о-тфильтровывают, растворитель упаривают при пэтгжснном . Остаток вносят в колонку (3 х 18 см), заполненную карбокс1тметилиеллюлэзой, и хроматографируют элюентами: О,ОО5 н, водным раствором ацетата аммония (1,(1л) и О,3 н. водным раствором ацетата аммония ( 1,О л). Фракпип от 8РО до 141Омл объединяют и лиофилизируют. продукта 38О мг (45% от теоретического); d.y -2,4° (с 0,5%: 5%-ная уксус гая кислота). НаЯдено,%: С 51,25; Н 7,29, N J 9 ,п8 заИ4в°5 г- С,,.з/2Н,о Вычислеяо,%:С 51,40-, Н 7,15; N 18,93 Аминокислотный анализ: Afg2,02 (2); QSs 1,00 (1); Ptie 2,02 (2); содержание пептида 73%. Пример 41. Получение (Ь-Аба-Аго -G,e -P he-Ptie-T r-NHj А. Получение l-Pi-AEa-Arp-CNO)-C,E -Ott К 26,3 г Z-Arg-(NO.j)-Qgv-OEt добавляют 13О мл 25%-ного раствора HBJf в уксусной кислоте н после встряхивания в течение 1 ч при комнатной температуре к смеси добавляют днэтиловый эфир. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат над гидроокисью натрии. Высушенный осадок растворяют в 150 мл ДМФ и после охлаждения раствора на бане со льдом его нейтрализуют триэтиламином. Затем добавляют 23,1 г Z--р г AEa-ONB и смесь оставлшот на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель отгоняют при пониженном давлении, остаток растворяют в ЗОО мл этилацетата, содержащего небольшое количество н-бутанола. Раствор промывают водой, насьпденным водньп раствором бикарбоната натрия. (10О мл х 3) и насыщенным воднь.м раствором хлористого натрия (1ОО мл X 3), псх:ле чего его сушат над безводным сульфатом натрия. Растворш- тель о-, гоняют при пониженном давлении и добавляют диэтнловый эфир. Выпавитй сх:адок отфильтровывают и перекрясталлизовывают из смеси ятанол/этвлацетат,. Выход продукта 22,9 г (73% от тес етического); тлл. 97-B9 ;rd3 -11.2° (с 0,9%; ДМФ). Найдено,%:С 49,51,- Н 6,06, .N 18,93 4.H,0,N, Вычислшо,%:С 49,50,-Н 6,13; N19,25 В. Получение Z-fb-Aeol- Apgr (NOj) G«y-OH. 12,1 г Z-J%-ACa-A g-C JOд)-( растворяют в смеси 50 мл адетона и 25 мл воды н при охтшжденки раствора на бане со смесью льда с хлористым натрием к нему по каплям в течение 30 мин добавляют 27,8 мл 1,О я. водного раствора гидрооквсв натрия. Полученную смесь в тех же условиях перкч ешнвают в течение 1 ч, затем еще 2 ч перемешивают при ком натной температуре н после добавления 3,8 мл 1,0 н, соляной кислоты адетон упаривают при пониженном давлении. К остатку добавляют 5О мл воды и смесь подкисляют 6,О н, соляной кислотой до образования ма лообразного вещества, которое вскоре затв девает. Полученный твердый продукт отделяют фильтрованием. Выход продукта 1О,3 г (86,0% от теоретического) у т.пл. lOl-lOa t; ,2° (с 1,0%;ДМФ Найдено,%: С 46,28; Н 5,41; N20,01 Ск,Н„0,М,;-1/2Н,0 Вычкслено,%: С 46,53; Н 5,75; N19,99 Г. Получение Z-Phe-Т р-ОМе 5,10 г Т Г-ОМе-нес суспендируют в 10О мл тетрагидрофурана и после охлаждения суспензии на бане со льдом ее нейтрализуют 3,08 мл триэтиламина. К смеси добавляют 5,99 г Z-Plie-OH , 3,94 г HONB и 4,54 г ДИГКДИ. Реакционную массу оставляют на ночь при постоянном деремешивашга. Образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают, а растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток растворяют в 20О мл этилацетата. Раствор промьшают насыщенным водным раствором бикар боната натрия (100 мл хЗ); 1 н. соляной кислотой (1ОО мл X 3) и водой, затем сушат над безводным сульфатом натрия Этилацетат упаривают при пониженном давлении, добавляют петролейный эфир и образовавшийся студенистый остаток отделяют фильтрованием и переосаждают из смеси этилацетат/петролейный эфир. Выход прод -кта 6,ОО г (63% от теоретического); Т.ПЛ. 132-133 ; Idli. -9,90(.0%; ДМФ). Найдено,%: С 68,О7; Н 5,92, N5,95 гуЧав б. Вычислено,%: С 68,О5-; Н 5,02; N5,88 Д. Получение I Ptie - - NH. 3,0 г Z- P1te-TVP - ОМе растворяют в 4О мл метанола, насьваеггаого аммиаком, и раствор в запаянной ампуле хранят иеделю до образования игольчатых кр)исталлов. Растворитель упаривают при пониженном давлении, диэтиловым эфиром осаждают продукт, выпавшие кристалл ы отфяльт- ровьшают и перекристаллизовывают из смеси этанол/вода. Выход продукта 2,61 г (9О% от теоретического); т.пл. 217-218°С .2&,e° (с 1,0%; ДМФ). Найдено,%: С 67,45; Н 5,88; N 9,05 Вьгчислено,%: С 67,66; Н 5.9О; N9,11. Е. Получение Z-Ptie-Т г-- NH-j. К 1,15 г Z-Ptie-T p-NH ;, добавляют небольшое количество анизола в затем 11 мл раствора НВ} в уксусной кислоте. После встряхивания смеси в течение 4О мин при комнатной температуре к ней добавляют диэтиловый эфир. Образовавшийся осадок отфильтровывают и высушивают над гидроокисью натрия. Параллельно с этим 0,67 г Z Phe-OH и 0,45 г растворяют в 5 мл тетрагидрофурана и добавляют 0,52 г ДЦГКДИ при охлаждении смеси на бане со льдом. Смесь перемешивают в течение 4 ч и образовавшуюся ДЦГМ отфильтровывают. Фильтрат добавляют к раствору полученного по описанной методике амкнокомпонента (H-Pt7€-T r-NH-|,) в 10 мл ЦМФ, нейтрализованномув(гриэтиламином, н смесь оставляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении и к остатку добавляют воду. Образс вавшиеся кристаллы отделяют фильтрованием, промывают этилацетатом и перекрнсталлизовывают из смеси ДМФ/этилацетат. Выход продукта 1,01 г (74% от теоретического); Т.ПЛ. 218-221°С (разложение); ,70 (с 1,0%: ДМФ). Найдено,%: С 69,О1; Н 6,О2,- N 9,23 C3fH,,0,N Вычислено,%: С 69,06; Н 5,96, N 9,21 Ж. Получение ( (О)--G,ev-Plre-P-he-Tvt-NH2, 0,91 г ZPTie - Ptie-Txr-NH суспендируют в смеси 30 мл метанола и 2О мл ДМФ и в течение 7 ч проводят каталитическое восстановление. Затем метанол упаривают при поыокеннэм давлении. Параллельно с этим 0,72 г Z-fb- ACa-AhgrCNOp -« ev-ОНи 0,32 г HONB растворяют в 5 мл ДМФ и, охлаждая.раствор на бане со льдом, добавляют 0,37 г ДЦГКДИ. Смесь
49
перемеигавагот в течение 6 ч и образовавшуюся ДЦГЛ отфильтровывают.Фильтрат добавляют к полученному по описанной методике аминокомпоненту (H Phe-Phe-TiJf 2. ) после чего смесь оставляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении и твердый остаток растирают в порошок с водой. Получившиееся порошкообразное вещество отделяют (фильтрованием и пересаждают из смеси ДМФ/этияапетат. Выход продукта 0,88 г {62% от теоретического); тлл. 174-177 ; dk..0 (с 1,0%; ДМФ).
Найдено,%: С 57.54; Н 6.18; N16.21 ,,
Вычислено,%: С 57.79; Н 6,О1; N 16.12
3. Получение р - АСа- Atg-Gey-Plte-Ptie -Tsf- HHj.
74O МГ Z- p -ABct- At-gCNO VQE -Pbe-Plie-T-iJr-HHjpafCTBc raBOfT в 3O мн уксусной кислоты и в течение 7 ч провод)гт каталитическое восстановление над палладвем. Затем катализатор отфильтровывают н { cnNворитель упаривают при поннхениом давлении. Остаток наноент на колонку (1,6 х 15 с заполненную ка| оксиметяпсефадексом, н проводят хроматогра4вао, используя но-градиентную эякягаю водными pacrreqp ми анетата аммоняя: О,ОО5 и 1,О н. (но 7ОО мл каждого раствсфа). Фракшв от 58О до 79О мл объедишвэт в ляофштэ руют. Выход продукта 54О мг (75% от тесчэетического); tj .О (с О.5%; вода).
Наадено,%: С 54.2О; Н 6,5О; N14.99
,o2CjH O Вычислено,%: С 54.О6-, Н 6,91; N 15,О1, Аминокислотный анализ: Др0О,95 (1),
«ie 1.05 (1); i.oo (1); Ptie2,oo (2); содержание нептяда 74%.
И. Получение дшштрата ft-ABq-Arcr-Gie -Phe-Phe-T h-NHj.
Ацетат, тригидрат днацетата В- Аба-Аг -QeiJ-Phe- tTe-Tv.« HHj (9,33 г) растворшот в 2О мл воды н к л&лу добавляют 2,2 г моногидрата лимонной Kocnotbi при перемешивании. О азов«шага)я кристаллический осадок отделяют фильтрованяем в промывают небольшим копичествотд холодной воды. Получают 1О,4 г соответствую щего дидитрата; -19,6° (с 1,0; вода).
Найдено,%: С 52,28; Н 5,87,- N12,46
e fo Nto-ZC.H.O Вычислено,%: С 52,54; Н 5,82; N 12,25 Пример 42. Получение y-Alju-Apg-- ev- tie- tTe-T:jp-NH.
«
50
A.Получение Z Т /Abu- (NO,)-Gev-oEt,
к 4,38 г z-A g-fNOg-j- qev-oEt
добавл5пот 4O мл 25%-ного раствора HBl в уксусной кислоте и после встряхивания смеси при комнатной температуре в течение ЗО мин добавляют днэтиловый эф1ф« ВьтадавшиЙ осадок отфильтровывают н сушат над гидроокисью натрия.
Затем его растворяют в ЗО мп ДМФ и носле охлаждет1Я на бане со льдом рвет, вор нейтрализуют триэтиламином, К раство- ру добавл5гют 4.16 г 7.-р АЪи- ONB и смесь сютавляют на ночь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривают при пониженном давлении и к остатку добавляют воду, которую зате. отделяют декантацией. К остатку добавляют диэтиловый эфир, выпавший в осадок продукт отфильтровывают н п реосаждают из ацетонитрила. Выход продукта 2,5 г (48% от теоретического). Т.Ш1. 60-62 0 dL -11,1° (с 1,0%; ОМФ).
Найдено,%:С 5О,12;Н 6,51 N18,73
C,,H,,OgM,
Вычж;лено,%: С 50,47; Н 6,35; N18,73 Б. Получение 2.--j-- Alju-Ang (N0)-c,e-i«- он
2,0 г Z- -Abu-Apg-CNOp-qe -OEt (растворяют в 2O мл ацетона, и охлаждая на бане со льдом, добавляют 5,7 мп 1 н. водного раствора гидроокиси натрия. Смесь пе5 га лешивают в течение 2 ч при комнат- ЗОЙ температуре. Затем добавляют 6 мл 1 н. соляной кислоты и упаривают ацетон при пониженном давлении. Выпадавшие кристаллы отфильтровывают н перекристаллизо- вывают из смеси этанол/вода. Выход продукта 1.86 г (98% от теоретического), т.пл. 113-1150С,- ,00 (с 1,1%;ДМФ
B.Получение Z - У АЪи-Apgf(NO-,VG|e-PЬe-Plie-T-ir-NH.
К 1,34 г Z-Phe-Plne-T ir-NHj, добавляют небольшое количество анизола и после этого 13 мл 25%-ного раствора НВ в уксусной кислоте.
После встряхивания смеси в течение 45 мин при комнатной температуре к ней добавляют диэтнловый эфир и выпадающий осадок отделяют фильтрованием и высуишвают над гидроокисью натрия. Параллельно с этим 0,99 г 2-7 -AЬu-Arg-CNOг)-Qev- ОН и О,43 г HCJNB pacTBOpsooT в 5 мл ДМФ и, охлаждая смесь, на бане со льдом, добавляют 0,50 г ДЦГКДИ. Смесь перемеЕшвают в течение 6 ч и отфильтровывают выпавшую в осадок ДЦГМ. Полученный по описанной методике амннокомпонент ( H- 1ie-РЪе-Та -ННЛрастворяют в 1О мл ДМФ и йейтрализугот раствор тряэтила ганом. К эт му раствору добавляют раствор полученног активированного эф1фа и смесь оставлягот на иочь при постоянном перемешивании. Растворитель упаривакэт при пониженном д лешш и к остатку добавл5пот воду. Вьшавшее порошкообразное вещество ,. отделяют 4л1льтрованием, промьюают этиладетатом н переосаждают из смеси ДМФ/этилацетат. Йыход продукта 1,12 г {58% от теорети ческого Т.ПЛ. 139.5 141°С; Л ,2 (с 1.4%; ДМФ), Е{айдено,%: С 57,76;{Н 6,43; N 15,91 47.rOi..Вычислено,%: С 58,19; Н 6,13; N 15,89 Г. Получение т - Abo-Arg--tVEt-Phe-Phe-br-NHj. 8OO мг Z- --Abu-Ar(WO)-Gгv-Ptre -Phe-T p- |H2pacтвopйют в ЗО мл уисуСйой кислоты и в течение 14 ч проводят каталитическое восстановление, яс пользуя палладий в качестве катализатора. Катализатор отфильтровьгоают и растворитель удаляют упариванииу тфп пониженном аавления. Остаток вносят в колонку (1,5 X 1О см), заполненну карбоксиметилсефадексом, и хроматографируют, используя линейно-градиентную элюишо водными раствсфами ацетата аммония: ОД и 1,О н. (по 7ОО мл каждого раствора). Фракции от 41О до 60О мл объедишпот и лиофялизвруют. Выход продукта 412 мг (52% от теоретЕческого); .-18,l° (с О,5%; вода), Наадено,%: С 54,О8- Н 7,О7; Н 14,6О Сз,,М,.С 8ычнспеао,%: С 54.О2: Н 7ДО; Ы 14,52 Амннокисиотньай анализ: AfP 0,96 (1); QSs 1.00 CD: Phe 2ДО (2); содержание пептида 84%. Пример 43. Получение f Асар-Arg--ere -phe-Ph$- T f-WHa. А, Получение 2-6-Ассяр - Агог(МО,)-r,ev-oEt. 2,42 г (N02VG(gi/-OEt встряхивают с 12 мл раствора НВР в уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 4О мин, добавя5Ш)т ДИЭТШ10ВЫЙ эфир. Вьшадавший осадок отделяют фильтрованием и высушивают над гидроокисью натрия. Параллельно с этим 1,33 г Z- g-Acap-ОН и 0,99 г НО N В растворяют, в 5 мл тетрагидрофурана и, охлаждая смесь на бане со льдом, добавляют 1Д4 г ДСС. Смесь перемешивают в течение 4 ч и отфильтровывают образовавшуюся ДИГМ. Полученный аминркомпонент растворяют в 10 мл ДМФ и после нейтрализации раствоа -фиэтяламином к нему добавляют полуенный раствор активированного эфира. месь оставлягот на ночь при постояннот п эемеишвании и отгоняют растворитель при пониженном давлении. Остаток раствояют в 5О мл этилапетат а, промьпвануг раствор водой, насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл х 2), и вновь водой, после чего сушат над безводным карбонатом натрия. Растворитель отгоняют при поииженном давлении и добавляют к остатку петролейный эфир. Выпавшие кристаллы от4нсльтровывают и перекристаллизовывают из смеси вода/этанол/этилацетат. Выход продукта 2,1 г (76% от теоретического); Т.ПЛ. 85-87°С; -11,9° (с - 1,0%: ДМФ). Найдено,%:С 52,43-, Н 6,64; Н 17.76 .зтOв Вычислено,%:С 52,2 6; Н 6,76; N 17,78 Б. Получение Z- - Асар- Apg ( N0 -qeu-oH 1,8 г Z-e-Agoip-Ahg-(NO,j-)-qey-Ott растворяют в 10 мл ацетона и, охлаждая раствор на бане со льдом, к нему добавляют 2,9 мл 2 н. водного раствора гидроокиси натрия. Смесь переметиивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем добавляют 2,5 мл 1 н. соляной кислоты, упаривают апетон при пониженном давлении и к остатку добавл5пот 1О мл воды, нераствсирившийся осадок отфильтровьтают. Фильтрат подкислзпот 1 н. соляной кислотой и вьшавшие кристаллы отфильтровьтаюа. продукта 1.59 г (93% от теоретического); Т.ПЛ. 97,5-99°С; Ы -10,7 (с 1,0%: ДМФ). НаЯиено,%: С 48,50, Н 6,28; Ч 18,23 Саг«,зО 7ВычисленО,%: с 48,79; Н 6,52; , N18,10. В. Получение 2-б-Дсар-Ar-g (NO)-GFe i -Ptie-Plre-Typ- NHj, К 1,22 г Z-Phe-Phe-Typ-NH добавляют небольшое количество анизола, затем 10 мл 25%-ного раствора НВ| в уксусной кислоте. Смесь встряхивают при комнатной температуре в течение 40 мин и продукт осаждают диэтиловым э4иром. Осадок отфильтровывают и сушат над гидроокисью натрия. Параллельно с этим 1,05 г (р-Arg-CNO)-GrEv-OH и 0,36 г HONB; растворяют в 10 мл ДМФ и, охлаждая смесь на бане с водой, добавляют 0,42 г ДЦГКДИ. Смесь перемешиваюв течение 6 ч и отх{)ильтровывают образовавшуюся ДЦГМ. Описанный аминокомпоиент растворяют в 1О мл ДМФ и нейтрализуют .раствор триэтиламином. К этому раствору добавляют полученны раствор активированного эфира и смесь ос тавляют на ночь при постоянном перемеши BaimH. Растворитель упаривают при пониж ном давлении и к остатку добавляют воду выпавший осадок отфильтровывают, промью ют этилацетатом и переосаждают из смес ДМФ/этилацетат. Выход продукта 1,О1 г (57% от теоретического); т,пл, 149-151° Tf -12,9° (с 1,1%; ДМФ). Найдено,%: С 59,63; Н 6,43; N15,03 .,Q Вычислено,%: С 59,5О; Н 6,32; N 15,5 Г. Получение 6- Atotp - Агсг - l; Erf-P11e-pЬe - Ttjr-МН. 7ОО мг Z - е-Асар - Arg(NO.VQty Pl1e-Phe-Tv -NH2 pacTBOpsnoT в 40 мл уксусной кислоты и в течение 14 ч проводят каталитическое восстановление, используя палладий в качестве ката пизатора. Катализатор отфильтровьтают, растворитель отгоняют при пониженном дав лении. Остаток вносят в колонку (1,8 х 12 заполненную карбоксимеггилсефадексом. и хроматографируют, используя линейно-градиентную ЭЛЮШ1Ю водяными растворами ацетата аммония: О,1 и 1,0 и. (по 7ООмл каждого раствЪра). Фракции от 43О до 550 мл объединяют и лиофилизируют. Выход продукта 43О мг (62% от теоретического); -13,2° (с 0,5%; вода). Найдено,%: С 55,48; Н 7,39: N14,47 Вычислено,%: С 55,43( Н 7,24, N14,3 Аминокислотный анализ: Ahgrl.OO (l) 1,00(1); Lvs 0,94 (1); ТУГ 1,OO (1); Plie 2,о7 (2).; содержание пеп тида 84%. Пример 44. Получение Lds-Afg-Ci& -Ptie-Plie-Т: г-NH. . А. Получение ди- Z- U s Avg- CNOj,) Qfcy-OEtЦелевой продукт получают по методик 43 А, используя 2,О7 г ди- Z - LVS -ОН в виде геля, который переосаж- дают из смеси вода/этанол/этилацетат ,, Выход продукта 2,57 г (73% от теоретического) Т.ПЛ. 161-162ОСГ -11,9 (с 1,О%; ДМФ). Найдено,%: С 54,45; Н 6,05, .Н 15,99 Вычислено,%: С 54,85; Н 6,33; N15,9 Б. Получение ди- Z- Uvs - Atg(НО)-(еа-он Раствор 2,0 г ди- Z- ЬУ .,)-G|6v-OEtв Ю мл ацетата охлг ждают на бане со льдом и добавляют 2,1 м 2 Н. водного раствора гидроокиси натрия, Смесь пероме 1ивают при комнатной Tovtпературе в течение 2 ч. Затем добавляют 1,4 мл 1 Н. соляной кислоты и отгоняют ацетон при пониженном давлении. Остаток разбавляют 10 мл воды и отфилтугровывают нерастйорившийся осадок. Раствор подкигляют 1 Н. соляной кислотой и выпавший студенистый осадок отделяют фильтропапиэм. Выход продукта 1,78 г (93% от т з:1оетического); т.пл. 131-132,.. -10,5 (с 1,0%; аЧФ). Найдено,% С 51,431 Н 5,92; N 16,23 ,,0 Вычислено,%: С 51,49; Н 6,2О; N 1 G,(U В. Получение ди- - Ar-g-( N0 V -QEv- Ptie-Ptre-Tyr- NH Используя 1,21 г ди-Z-b-ib- (NO.,Y-QCvOH воспроизводят методику примера 43 В. Получают 1,21 г (58% от тпретического) соедитения в виде геля, т.пл, 199-2030С; , -13,3° (с 1,О; ДМФ). Найдено,%:С 58,70гН 6,2в: N14,7:. C.A«°l,Nz2H,0 Вычислено,%: С 58,75; Н (1,23; N Ы, .. Г. Получение ЬУ$ - Afg--Q-Es - Ptie-PlTf NH, В ЗО мл уксусной кислоть: растворяют 1,ОО г ди- Z - Uvs-Afg-CNO -QE - P iePtie-T-sfr - NHj и в присутствии пяллациевой черни как катализатора проводят в течение 2О ч каталитическое восстанов/юние. Катализатор отфильтровывают и растворитель отгоняют при пониженном давлении.. Остаток хроматографируют на колонке (1,8 X 10 см) с карбоксиметилосфадексом. Элюцию осуществляют методом линейного градиента, используя водные растворы ацетата аммония от 0,1 (500 мл) до 1 н. (5ОО мм). Фракции от 65О до 89О мл объединяют и лиофилизируют. Выход прод укта 468 мг (БО% от теоретического); dJ -10,6° (с 0,5%; вода). Найдено,%: С 52,7О; Н 7,31-, N14,72 C4iH5AN.,-4H,0 Вьгчислено,%: С 52,84; Н 7,27; N14,43 Аминокислотный анализ: Afg 1,00 (1), 0,94 (1); еу 1,00 (1); 1 1,00 (1); PTie 2,Об (2), содержание 82%. П р и м е р 45. Получение Л,)аЬ -Ap§--QEv- p-he-p-he -Т:#г- NH. А. Синтез ди- Z.-ot,-БаЬ - ArgC N0)-G,ev-OEt. В 4О мл диэтилового эфира суспендируют 2,84 г ди- Z - dL,)П-Д1и Л (ДЦГА - дициклогексиламин) и -полученную суспензию встряхив. о 0,5 и. coy)55ной кислотой, эфирный слой отделятот, промывают водой и сушат нал безводньтм суль фятом натрия. Растворитель отгоняют в ва кууме и дальнейшие манипуляции с остатком производят в точном соответствии методикой примера 43 А. В результате по лучают соединение в виде геля. Продукт пёреосаждают из смеси в ода/этан о л/этилацетат. Выход продукта 2,36 г (70% от теоретняеского); т.пл. 153-15б°С; сА. -9.40 (с 1,0%; ДМФ). Найдено.%: С 53,26; Н 5.84; N16,24 .о.Л Вычислено,%: С 53,56; Н 5,99; N116,6 Б. Синтез ди 2 cC.-Dab-Argr(ND -G,Ev-OH. В 10 мл ацетона растворяют 2,0 г ди- Z - oC,J-Do(t)(N02) и к получен ному раствору при охлаждении на ледяной бане прикапывают 2,97 мл 2 н. водного раствора гидроокиси натрия. Смесь перемешивают в указанных условиях в течение 1 ч, после чего прибавляют 3 мл 1 н, соляной кислоты. Ацетон отгоняют при пониженном давлении и к- оставшемуся раствору прибавляют 10 мл воды. Нерастворившиеся npmviecH отфильтровывают и фильт рат подкисляют соляной кислотой. Образовавшийся при этом желатиноподобный осадок отделяют от маточной жидкости фильтрованием. Выход продукта 1,67 г {9О% от теоретического); т,пл. продукта 112- изос; Л -8.3 (с 1,1%; дмФ). Найдено,%:С 50,53; N5,59, N17,19 С Н О N -НО ге 36 1о 8 2. Вычислено,%:С 5О,55; Н 5,76; N16,8 В, Получение ди- 2 d., f - Ddb Afgf (NO)-QEvPhe-P ie-T r-NHj. Испольауя 1,12 г ди- Z , - 1йаЪ -ApgrCNOj,) ОН , воспроизводят методику примера43 В. В результате получают 1,О2 г (51% от теоретического) соедшения в виде геля; т.лл. 191-1950С ,0° (с 0,9%;ДМФ). Найдено,%: С 59,13: Н 6,14, N15,46 ..N.R.O ВычисленоД: С 59,О2;Н 5,95; N 15,О2 Г. Получение ci-,-у-БаЪ - ,ev - Pti -p1ie-Tbit--NH2- . В ЗО мл уксусной кислоты растворяют 600 мг ди- (.,. -Це p-he-P-he-Tyr- NH и. .исполь зуя палладиевую чернь в качестве катализатора, проводят в течение 12 ч каталитическое восстановление. Катализатор отфильтровывают и растворитель упаривают при пониженном давлении. Остаток хрок;атрографируют на колонке (1,8 х 10 см) с к
56 боксиметилсефадексом. Элюцию осуществляют методом линейного градиента от О,1 н. водного раствора ацетата аммония ( 5ОО мл) к 1 н. водному раствору ацетата аммония (5ОО мл). Фракции от 49О до 62О мл объединяют и лиофилизируют. Вьгход продукта 241 мг (43% от теоретического): с,.. -17, (с 0,6%; вода). Найдено,%: С 52,12; Н 6,99; N 15,31 Сз,.зОг.С,,.4Н,0 Вычислено,%: С 51;96, Н 7,08; N 14,82 Аминокислотный анализ: 1;ОО (1); Dab 1,О4 (1); (З-Су 1,09 (1); Tvr 1,02 (1); Phe 2,13 (2); содержание пептида 79%. Формула изобретения Способ получения полипептидов эбШсй формулы Т - Ahgr- Rj-Phe - Phe- , где R - атом водорода или остаток основной или нейтральной аминокислоты, нейтральный аминокислотный остаток, R - NH,, Tvr - NHj , остаток тирозильного пептида, содержащего в своем составе от 1 до 5 аминокислотных остатков, или остаток амида тирозильного пептида, при условии, что, когда R.- атом водорода, R соответствует Pro , отличающийся тем, что аминокислоту, соответствующую R или аргинин, в том числе, когда R/ представляет собой атом водорода или пептидный фрагмент полипептида указанной формулы, содержащий аминокислотный остаток R или аргинильную группу в том случае, когда I. представляет собой атом водорода, в качестве N -концевой аминокислоты, конденсируют с недостающим фрагментом полипептида, причем каждое из исходных соединений может быть защищено по своим амино- и карбоксильным группам, которые не должны принш ать участие в конденсации, и может быть активировано по тем амино- или карбоксильным группам, которые непосредственно участвуют в указанной реак1ши конденсации, с последующим удалением защитных групп из полученного полипептидного продукта. Приоритет по признакам: 26.03.74при.К. - остаток основной аминокислоты или остаток нейтральной аминокислоты Отличной от еЛ, -аминокислоты; R - глицинГ Kg - NH,, - NH, 24.01.75при R - основной или нейтральный аминокислотнь Ё остаток, R - нейтральный аминокислотный .я;- чаток,
П758
R -- ( , TV - NVi,j, остаток тирозиль-ляет собой Gtv и Rj прюдгтпвляет соногоцпитида, содсржаиияч) в своем составебой МНд или Tvh-NH , R означает
от 1 ло 5 ампнакислотн(,1х остатков или егоci--аминокислотный остаток; когпа R ггропамнл, при условии, что, когда R., п едстав-ставляет собой пролин, R, - ато( т/юрода.
577075
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДОВ И СПОСОБ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 1992 |
|
RU2087480C1 |
| Полипептид,обладающий способностью уменьшать содержание кальция в сыворотке | 1979 |
|
SU1028662A1 |
| СЕЛЕКТИВНЫЕ ЦИКЛОПЕПТИДЫ | 2001 |
|
RU2239642C1 |
| Гептапептид в качестве стимулятора памяти пролонгированного действия | 1981 |
|
SU939440A1 |
| Способ получения октапептида | 1983 |
|
SU1147010A1 |
| ИНГИБИТОРЫ ФАКТОРА ХА | 1995 |
|
RU2152954C1 |
| Способ получения производных борсодержащих пептидов | 1988 |
|
SU1807988A3 |
| RGD-СОДЕРЖАЩИЕ ПЕПТИДЫ | 2001 |
|
RU2214416C2 |
| ПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АНТИКОАГУЛЯНТНО-ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ, АНТИТРОМБОЦИТАРНОЙ И АНТИТРОМБОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ | 2005 |
|
RU2286166C1 |
| ЛИПОФИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ПЕПТИДНЫХ ГОРМОНОВ | 1996 |
|
RU2171261C2 |
