ю
ас сх Изобретение относится к микробиологии и касается получения прот нового комплекса, который может бы использован в медицине, при лечени и предотвращении различных видов диабетов. Цель изобретения - получение пр теинового комплекса, стимулирующег . секрецию инсулина. Цель достигается тем, что спосо получения протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, заключается в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относящиес к виду Bordete eа pertussis, в 1-о фазе культивируют в жидкой питательной среде при встряхивании, получе ную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкос пропускают ее через колонку, элюир целевой продукт фосфатным буфером 0,5м NaCe рН 7,0, полученный элюа концентрируют, очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступе чатой хроматографии на компоненты КС-1 с мол. вес. 63000+5200, КС-1Г с мол. вес. 31000+4500 и/или КС-Ш с мол.вес. 12500+1500. Протеиновый комплекс, стимулирую щий секрецию инсулина, является белковым веществом, которое может быть получено при культивировании, микроорганизмов, принадлежащих к ми роорганизмам BordeteCCa pertussis, которые являются патогенными бактериями например, бациллы коклюша, паракоклюша и бронхиальной -септице мии), причем наиболее предпочтитель ными являются BordeteEGa pertussis первой стадии. Способность патогенных микроорганизмов вида BordeteCpa pertussis по продукции протеинового комплекса приведена Е табл. 1. Таблица Штаммы Относительный выход Патогенные Мае по (контрольный) Tohama 3379 В 18-323 7341 Непатогенные Sakairi Miyazaki Вьщеление и очистку протеинового ; комплекса из культуры осуществляют с помощью известных способов, например осаждения,.хроматографического метода, метода с использованием молекулярных .сит, электрофоретического и биологического методов, причем с использованием либо каждого в отдельности, либо в соответствующих сочетаниях.5 Способ с использованием хроматографической колонки является удобным для выделения и очистки комплекса, при этом надорадочную жидкость культуральной среды,пропускают через колонку, заполненную такими носителями, как гидроксиапатит, СМ-сефароза , Coh А-сефароза 4 В или РАМАсефароза 6МВ. Протеиновый комплекс адсорбируется в колонке, а затем элюируется из нее подходящим элюирующим веществом, например буфером 0,1 М фосфата (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCC. Очищенный продукт подвергают диализу, чтобы избавиться от ненужных солей, после чего получают чистый протеиновый комплекс. Комплекс присутствует также в культивируемых клетках бактерий, при необходимости его выделяют, добавляя NaCt к суспензии для выцелачивания комплекса в раствор. Для получения протеинового комплекса можно использовать метод осаждения сульфатом аммония, в этом случае твердый сульфат аммония добавляют к надосадочной жидкости культуры до точки, приближающейся к растворимости насыщения, и устанавливают рН 6-7 разбавленной аммиачной водой. Затем осадок промывают водой, а комплекс экстрагируют из 0,1 М трисбуфера (рН 8), содержащего 0,5 М NaCf. Порошок протеинового комплекса, полученного сушкой при температуре ниже точки замерзания, после обессоливания не расплывается на влажном воздухе, белого или светло-коричневого цвета, растворяется в воде при комнатной температуре в концентрациях о 3-5 мг/мл. Если его поместить в 6 н.НСЕ, то он образует нераствориый белый осадок. Растворяется в пиидине, додецилсульфате натрия, мераптоэтаноле и растворе цистина. При обавлении смеси сухого льда с ацеоном или этанолом, трихлоруксусной ислоты или раствора хлористого цина или раствора, содержащего некотоые другие типы ионов металлов, к аствору очищенного активного материаа в охлажденном состоянии () поучают мутно-белый осадок. Если ротеиновый комплекс помещают в смеанный раствор воды и хлороформа или -бутанола, то он становится нерастворимым и собирается около поверхости раздела обеих жидкостей. Если водный раствор протеиновогб комплекса нагревать до или выш он становится мутно-белым. Таким же образом, если этот комплекс растворить в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 0,5 М NaC, а затем подвергнуть диализу, использу в качестве внешней жидкости дистиллированную воду, комплекс постепенн становится мутно-белым, однако при продолжении диализа комплекс снова растворяется н белая муть исчезает. Если раствор с высокой концентрацие подвергнуть тщательному диализу с использованием 0,01 М ацетатного бу фера (рН 4,5), то комплекс может пр нять светло-коричневую окраску и раствориться. Молекулярный вес протеинового комплекса 77000+6400. Содержание белка более 95 вес.%, а содержание глюцида приблизительно 1%, концентрация липидов меньше нижнего предел определения. Композиционное отношение мкМ/100 16-или 24-часовой гидролиз при ИО в 6 н.нее, Аспаргиновая кислота 7,5-7,9, треонин 6,8-7,6, серин 5,9 7,6, глутаминовая кислота 9,7-10,8, пролнн 5,5-6,4, глицин 8,7-9,6, аланин 9,1-10,8, цистин 1,5-2,6, ва лин 5,6-6,6, метионин 2,5г-3,3, изолейцин 3,6-4,1, лейцин 7,5-8,0, тирозин 5,1-6,6, фенилаланин-3,33,9, лизин 3,1-4,4, гистидин 1,41,6, аргинин 6,1-6,6. Протеиновый комплекс оказывает стимулирующее действие на секрецию инсулина, это действие длится от нескольких недель до нескольких месяцев после введения единичной дозы Острая токсичность LDj составляет 200 мкг/кг живого веса для мьлией шт ма ddy. Протеиновый комплекс раздел.яют на три компонента с Помощью хромато рафии н-а колонке в присутствии известных среДств для .денатурации бел ков , таких как 8 М мочевина и 6 М хлоргидрат гуанидина. Гель-фильтрация в присутствии 8 М мбчевинн предусматривает раство рение протеинового комплекса в 0,1 фосфатном буфере (рН 7,0), содержащем 8 М мочевины и О,.5 М ЫаСВ, зате полученную смесь подверггиот гельфильтрации на колонке, заполненной Сефакрил S-200, находящимся в равно весии с указанным буфером. В резуль тате протеиновый комплекс разделяют на три компонента с различным молекулярным весом (KC-I с мол.вес. 63000t5200, KC-1I с мол. вес.31000+ 4500 и KC-I11 с мол.вес. 12500+ 1500), и дополнительная гель-фильтрация на той же колонке приводит к тому, что эти компоненты при дисковом электрофорезе выходят как отдельные вещества. Другим способом вьщеления и очистки комплекса может быть хроматографирование на колонке с ДЕАЕ-цеЛлюлозрй, при этом протеиновый комплекс растворяют в 0,01 М фосфатном буфере (рН 8,0) , содержащем 8 М мочевины, затем пропускают через колонку с целлюлозой ДЕЛЕ, уравновешенной тем же сакшм буфером. Соответственно, KC-I и KC-II адсорбируются на этой колонке, KC-1II не адсорбируется, а протекает вниз, КС-1 элюируют 0,02 М фосфатным буфером (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а KC-II элюируют 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0) . Эти компоненты при дисковом электрофорезе проявляются как отдельные вещества после гель-фильтрации через колонку с Сефакрилом S-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором, содержсццим, 4 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия. Полученные тажим образом компоненты КС-Г, КС-11 и KC-I11 облгщают более , низкой стимулирующей активностью секреции инсулина, чем исходный протеиновый комплекс. При некоторых условиях разделения протеиноЕОго комплекса на составляющие его компоненты каждый из компонентов можно разделить далее на более мелкие белковые фрагменты. Например, разделение протеинового комплекса с использованием 0,1 М фосфатного буферного раствора, содержащего 4 М мочевины, 1% 2-меркаптоэтанбПа и 0,5 М NaC с последукнцей гельфильтрсщией через колонку с сефакрилом S-200, Уравновешенным указанным буферным раствором, приводит к получению 5 белковых фрагментов, которые содержат два дополнительных компонента вдобавок к трем компонентам. В отдельности вещества КС-1, КС-11, КС-Ill обладают недостаточной активностью стимулирующей секреции, но их соединение в определенные группы, например, КС-1 и КС-111, КС-11 и КС-1II и КС-1 и КС-Ill приводит к высокой активности, а сочетание КС-1 и КС-11 является неактивным. Когда компоненты КС-1 и КС-111, КС-11 и КС-111, КС-1, КС-11 и KC-ill и КС-1 и КС-11 взаимодействуют в определенном буферном растворе, они образуют отдельные белковые ассоциированные соединения, которые названы ассоциированными веществами КСА-1, KQA-1I, KCA-lIi и КСА-1У соответственно. Белковые ассоциированные вещества получают следующим образом. Смешивают соответствующие сочетания элементарных веществ, взятых в соотношениях КС-1: КС-11 5:1 в случае КСА-1, КС-11: КС-1 II 2:1 в случае КСА-11; КС-1:КС-11:КС:111 5:2:2 в случае КСА-111, и КС-1:КС-11 2:1 в случае КСА-1У (вде соотношения по весу белка) , в ОД М фосфатном буфе ном растворе (рН 7,0) , содержащем 2 М мочевины и 0,5 М хлористого нат рия, затем встряхивают в течение 24 ч при 37°С, при этом вещества в соответствующих комбинациях взаимодействуют друг с другом. Потом эти смешанные растворы концентрируют и подвергают гель-фильтрации на колон ке с сефакрилом S-200, уравновешенны 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 2 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия, или ионооб менному хроматографическому разделе нию ассоциированных и неассоциированных элементарных веществ, получив при этом отдельные ассоциированные вещества КСА-1, КСА-11, КСА-111 и КСА-1У соответственно. Выходы ассоциированных продуктов сильно изменяются в зависимости от условий обработки и температуры,рН, времени, плотности и ионных сил. Обнаружено также, что новые белковые ассоциированные вещества, хотя практически равны по основной активности протеинового комплекса, обладгиот менее 1/50 лейкоцитозной активности менее 1/10 активности повышения чувствительности к гистамину, менее 1/25 актигенности и менее 1/3 велйчи ны LDjQ по сравнению с соответствующими значениями для протеинового комплекса. Свойства и растворимость элементарных и ассоциированных веществ. Тонкойзмельченные.порошки всех обессоленных и высушенных при температуре ниже точки замерзания элементарных и ассоциированных веществ являются порошками, кчэторые не расплываются на влажном воздухе (из-за гигроскопичности). КС-111, КСА-11 и KCA-II1 растворимы в воде в количествах до 1 мг/мл при комнатной температуре, тогда как другие плохо растворяются в воде, но растворяются до 4 мг/мл в 0,1 М фосфатном буферном растворе, содержащем 4 М мочевины и О,5 М NaCG. Водные растворы указанных веществ становятся мутно-белыми и образуют Осадок, когда к ним добавляют суль1фат аммония, сухой лед с ацетоном, этанол. Трихлоруксусную кислоту или ансшогичные соединения при 4с. Каждое из веществ, помещенное в смешанный раствор воды и хлороформа иля и-бутанола, собирается вокруг поверхности раздела жидкостей. Молекулярный вес соответствующих элементарных веществ, определенных гель-Фильтрацией на колонке (1,5х 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенным 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и 0,5 М Nace, следующий: КС-1,63000+5200; KC-I1 31000±4500г КС-111 12500+1500. Молекулярный вес соответствующих ассоциированных веществ, как было определено с помощью колонки (1,5х 95 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенным 0,1.М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержгицим 4 М мочевины и 0,5 М NaCe, следующий: КСА-1 75000+8500; КСА-И 35000+4500 КСА-И1 85000± 13000, КСА-1У 88000+6300. Изоэлектрические точки рН соответствующих веществ, измеренные при помощи методики электрофокусировки акриламидного геля, следующие: КС-1 5,6+0,3; КС-11 5,4+0,4; КС-111 8,3+0,3; КСА-1, 6,8±0,4; КСА-11 6,3 0,зТ КСА-111 8,2±0,5; КСА-1У 5,6+0,4. В табл. 2 представлены составы протеинового комплекса. Таблица 2 Состав аминокислот белковой составляющей и процентное содержание композиции (мкМ/100 мкМ) приведены в табл. 3. Таблица 3
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕИНОВОГО КОМПЛЕКСА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО СЕКРЕЦИЮ ИНСУЛИНА, заключающийся в том, что патогенные штаммы микроорганизмов, относ вциеся к виду BordeteEKa pertussis, в 1-ой фазе культивируют в жидкой питательной среде при встряхивании, полученную культуральную жидкость прогревают, отделяют надосадочную жидкость, пропускают ее через колонку, элюируют целевой продукт фосфатным буфером с 0,5 М NaC8 рН 7,0, полученный элюат концентрируют, очищают и разделяют протеиновый комплекс методом ступенчатой хроматографии на компоненты КС-1 с мол.вес. 63000+5200, KC-1I с мол.вес. 31000±4500 и/или КС-111 с мол.вес. 12500+1500..
:Аспарагиновая кислота (Асп)8,1
Треонин (Тр)8,5
9,3
5,3 7,7 4,8
Серии (Сер) Глутаминовая кислота
Пример 1. Получение и очистка протеинового комплекса.
Высушенные при температуре ниже точки измерения и хранившиеся бактерии BordetefEа pertussis штамм МаеЪо 1 фазы культивируют а чашках в среде Bordet-gengon при 2 дня потом платиновую петлю с культурой указанной бактерии инокулируют во встряхиваемую колбу емкостью 500 мл, в которой было 200 мл ионообменной смолы, с добавкой модифицированной, среды Cohen Wheeler (CW-среда), состав которой указан в табл. 4, а да-. тем встряхивают эту культуру 20-22 ч при 37°С. Концентрацию бактерий в растворе культ-урн определяют с помощью спектрофотометра (длина волны 650 нм), и этот раствор добавляют в двухлитровую встряхиваемую колбу, в которую вводят 1 л ионообменной смолы с добавкой CW-среяы, таким образом, что окончательная концентрация бактерий приблизительно 0,1х . 10 клеток/мл, после чего встряхивание ку Тьтуры продолжают 48 ч (частот |встряхиваний 97 раз/мин при . Микологические свойства вьяиеуказанного штамма соответству рт данным для штамма бактерий коклюша 1 стадии
Продолжение табл. 3
9,8
7/9
6,2
Таблица 4
|1ервичный кислый фосфонокислый калий, г
Растворимый крахмсШ, г
0,5%-ный раствор сульфата меди, мл
1%-ный раствор хлористого кальция, мл
4%-ный раствор хлористого магния, мл
Полипептон, г
1%-ный раствор цистина, мл Продолжёние табл. 4 0,5%-ный раствор сульфата железа, мл Хлористый натрий, г При использовании мадифицированной жидкой среды ее добавляют с дистиллированной водой, доведя полн количество до 1000 мл и после установления рН 7,2 20%-ным раствором NaOH к раствору среды добавляют еще 3 г анионообменной смолы (Diaion SA-20 АР, Mit-subishi Kasei Co.), а затем подвергают стерилизации паром высокого давления при 15 мин. Полученный в результате 48-часового встряхивания раствор культуры нагревают при 5б°С 30 мин, а затем центрифугируют (15000 об/мин) при 4°с для того, чтобы разделить нгщоса дочную жидкость и клетки бактерий. Полученную таким образом надосадочную жидкость из раствора культуры используют в качестве исходного мате риала для очистки и вьще.рения целевого протеинового ко14плекса. 10 л полученной таким образом надосадочной жидкости после установления рН 6,0 с помощью 1 н, нес пропускают через колонку (2,5x4 см), за полненную оксиапатитом при скорости потока 200 мл/ч в качестве первой стадии очистки. Большая часть белка проходит через колонку, не абсорбируясь на ней Концентрация белка, определенная по методу Лоури, приведена в табл. 5 Для определения абсорбированного вещества колонку промывают вначале 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0), а затем, после повышения молярной концентрации фосфатного буферного раствора до 0,1 при рН 7,0, абсорбированные белки эффективно элюируют из колонки. Однако при этих условиях протеиновый комплекс из колонки не был элюирован. Поэтому проводят дополнительное элюирование фосфатным буферным раствором той же композиции, но содержащи.м 0,5 М NaCC В этих условиях целевой протеиновый комплекс удается вьщелить с высокой степенью активности в соответствии с элюированным белком. Полученный таким образом протеино вый комплекс концентрируют и после помещения его в мембрану для диализа с максимальной проницаемостью для мол. веса 8000, дважды подвергают диализу (в течение 12 ч) с дистилли-i рованной водой и дважды (в течение 12 ч) с 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Для дгшьнейшей очистки раствор, содержащий протеинбвый комплекс, пропускают через колонку (1,5x10 см), заполненную карбоксиметилсефаровой С8-6В, уравновешенной 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 6,0). Материал, который не был абсорбирован в этой колонке, не обладает активностью. После повышения молярной концентрации к рН фосфатного буферного раствора до величин 0,1 и 7,0 соответственно проводят аналогичное элюирование, добавив 0,5 М физиологического раствора, после чего получают протеиновый комплекс в соответствии с элюированным белком. Так как при определении методом дискового электрофореза полученный продукт еще содержит небольшое количество примесей, этот протеиновый комплекс концентрируют далее и, после помещения в мембрану для диализа, дважды подвергают диализу (всего в течение 12 ч) с дистиллированной водой и дважды (всего в течение 12 ч) с 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0). Полученный после диализа образец пропускают через колонку (1,58 см), заполненную Con А-сефарозой 4в, которую уравновешивают 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0) . При обработке тем же буферным раствором элюируют следовые количества белка, однако эта белковая фракция не обладает активностью. При дальнейшем элюировании 0,1 М фосфатHtJM буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М Ыасг, получают протеиновый комплекс в соответствии с элюированным белком. Так как эта порция белка еще содержит мельчайшее количество примесей при определении с помощью дискового электрофореза, ее собирают, концентрируют и подвергают диализу с- 0,01 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 0,5 М NaCE. дбразец после диализа подвергают гель-фильтрации на колонке (2,8 60 см), заполненной биогелем Р-100, уравновешенным тем же буферным раствором. В результате получают чистый активный фактор, соответствующий белковой фракции, дающей пик молекулярного веса около 80000. Эффективность выделения, очистки и другие, данные, полученные на этой стадии очистки, приведены в табл. 5. в качестве стандарта используют коровий сывороточный альбумин. Чистоту вещества определяют в соответствии с данными дискового электрофореза на полиакриламидном геле (концентрация полиакриламида 7,5%, 1 н.КОН - ледяная уксусная кислота в качестве буферного раство ра (рН 4,3). Количество образца на гель ссхзтавляет 30 мкг (в виде белка). Эксп римент проводят, подавая ток 4 МА в течение 2 ч, проявляя амидочерным 10 В и обесцвечивая 7%-ным растворо уксусной кислоты. Образец, полученный на этой конечной стадии, является отдельным веществом, практически свободным от примесей, и стимулирующая секреция инсулина .хорошо согласуется с актив ностью для этого выделенного вещест ва. Для определения структуры субъе ницы этого вещества его подвергают затем дисковому электрофорезу с SDS (додецилсульфат - натрия) в соответствии с методикой Шапило. 50 мкг пробы вещества (в расчете на белок) добавляют к смеси 1% SDS 1% меркаптоэтанола и 4 М мочевины. После 2 ч инкубирования при полученную смесь наносят на 10%-нБй полиакриламидный гель, содержащий 1% SDS, затем 4 ч пропускают ток 8 мА/гель, проявляют Coomsie голубы и обесцвечивают 7,5 уксусной кислотой . Полученные результаты приведены в табл.9. Высушенные при температуре ниже точки замерзания и хранившиеся бактерии коклюша Bordete ea стадии 1, штамма Tohama- культивируют .в среде Bordet gendon (Bg-среда), содержаще 20% дефибринизированной лошадиной крови, при 3 дня, потом в тече ние 20-24 ч культивируют в В скоТаблица 5 шенной среде при , а затем платиновую петлю культуры бактерий инокулируют в .500-миллиметровую лстряхиваемую колбу, в которую предварительно помещают 200 мл ионообменной СМОЛЫ, к которой добавляют полусин-. тетическую жидкую питательную среду (модифицированная среда Cohen-WheeKег), состав которой приведен в табл. б, после чего культуру встряхивают в течение 20-24 ч при 37°С. Концентрацию бактерий в растворе культуры определяют с помощью спектрофотометра (длина волны 650 нм)., и полученный раствор добавляют в двухлитровую встряхиваемую колбу, в которую перед этим помещают 1л указанной CW-среды, так что окончательная концентрация бактерий достигает 0,07 до 0,1510 клеток/мл. После этого культуру встряхивают в течение 4 ч при 37°С (частота встряхивания 100-120 раз/мин). Полученный таким образом встряхиваемый раствор нагревают при 30 мин, затем центрифугируют (со скоростью 15000 об/мин) при 4°С для того, чтобы отделить надосадочную жидкость от клеток бактерий. Т а б л и ц а 6 Количество Состав модифицированной среды Казаминовая кислота, г10 Дрожжевой экстракт, г1 Первичный кислый фосфор;нокислый калий, г0,5 Растворимый крахмал, г2 0,5%-ный раствор сульфата меди, мл1 Продолжение табл. 1%-ный раствор хлористого кальция, мл 4%-ный раствор хлористого магния, мл Полипептон, г 1%-ный раствор цисти на, мл 0,5%-ный раствор сульфата железа, мл Хлористый натрий, г При использовании этой жидкой среды ее разбавляют дистиллированн водой до получения общего количест ва 1000 мл, и после установления в личины рН 7,2 с помощью 20%-ного раствора NaOH к ней еще добавляют 3 г анионообменной смолы (Диаион А-20АР), после чего стерилизуют 1520 мин паром высокого давления при 21°С. 10 л полученной таким образом на досадочной жидкости культурной сред пропускают через колонку (5- 2 см, скорость потока 60 мл/ч), заполненн океиапатитом, промывают 100 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 6,0). После этого колонку промывают 300 мл О,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0), и 0,1 фосфатным буферным раствором (рН 7, содержащим 0,5 М хлористого натрия, со скоростью 15 мл/ч для элюировани целевого активного фактора. Полученный таким образом протеиновый комплекс концентрируют до 15 мл с полиэтиленгликолем (средний мол.вес 20000) и подвергают диализу четыре раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, затем еще четыре раза подвергают диализу за 24 ч с 1 л 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 6,0) до равновесия. Затем полученный продукт пропускают через колонку (1,5-10 см), заполненную Асп Тр Сер Глу Про Гли Ала Цис/2 Вел нем ты тво °° Примечание. Гидролиз в6 н. НС боксиметилсефарозой CL-бв, уравнове- шейной тем же самым буферным раствором, что и ранее. Тот материаш, который не был абсорбирован в колонке, не обладает активностью. После повышения молярной концентрации и рН фосфатного буферного раствора до 0,1 М и 7,0 соответственно проводят аналогичную обработку, добавив 0,5 М хлористого натрия, и получают протеиновый комплекс, соответствующий элюированному блоку. Этот протеиновый комплекс концентрируют до 10 мл и подвергаиот диализу 4 раза за 24 ч с 2 л дистиллированной воды, после чего проводят 4-кратный диализ в течение 24 ч в равновесии с 1 л 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 4,5 раствора, содержащего 0,1 М хлористого натрия, или рН 4,5 при содержании 0,1 М литийхлорид - соляная кислота). Этот раствор пропускают со скоростью 5 мл/ч через колонку (1,28 см), заполненную Р-ацетоксимеркуранилин-сефарозой 6МВ, уравновешенной указанным буферным раствором, с последующей тщательной, промывкой им (около 200 мл). Абсорбированный материал элюируют тем же буферным раствором, в который добавляют 0,01 М г-цистина. В неабсорбированной фракции нет протеинового комплекса, весь он в окончательном элюате. Этот протеиновый комплекс шесть раз подвергают диализу в течение 48 ч с 2 л дистиллированной воды, .высушивают при температуре ниже точки замерзания,в результате чего получают 7,3 мг светло-коричневого порошка. Полученный продукт дает отдельную полосу при электрофорезе на полиакриламидном геле (используется гель с рН 4,3) а его изоэлектрическая точка рН составляет 7,8+0,5. Продукт содержит, вес.%: белок около 92, глюцид 1,8-5,6 и липиды 0-2. Молекулярный вес этого вещества по данным гель-фильтрации (с использованием биогеля Р-150 на колонке разме- / ром 1,8-95 см и 0,01 М ацетатным буферным раствором с рН 4,5) 510001. 4300. В табл. 7 представлен состав амийокислот полученного продукта. Таблица 7 Mem Ил Лей Тир Фе Лиз Гис Apr при 110°с в течение 16 ч. Эффективность ввделения, чистота и другие данные, полученные на укаСтимулирующая секрецию инсулина активность составляет 1,349 U мкг, острая токсичность LDcQ 232 мкг/кг для самцов ГФпаей и 174 мкг/кг для мышей-самок. Пример 2. Получение и очистка компонентов. 1.20 мг очищенного протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, растворяют в 3 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0), содержгидего 8 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия, и после выстаивания смеси в течение 2 ч при 37°С ее подвергают гель-фильтрации на колонке {1,595 см), заполненной сефакрилом S-200, уравновешенной указанным буферным раствором. Таким способом протеиновый комплекс разде ляют на три компояента с различным молекулярным весом (KC-I, КС-Г1 и КС-Ill в порядке возрастания молекулярного веса). Для того, чтобы пр вести дальнейшую очистку этих компо нентов, их фракции собирают, концентрируют и снова подвергают г.ельфильтрации на той же колонке. 2.20 мг очищенного протеинового комплекса, стимулирующего секрецию инсулина, растворяют в 3 мл 0,01 М фосфатного буферного раствора (рН 8,5), содержащего 8 М мочевины и после выстаивания смеси в течение 2 ч при его пропускают через колонку (1, см), заполненную ДЕАЕ-целлюлозой, уравновешенную указанным буферным раствором. КС-11 проходит через колонку, не абсорбируясь на ней, а КС-1 и KC-1I абсорбируются в колонке. КС-1 элюируют 0,02 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины, а КС-11 - 0,05 М фосфатным буфером (рН 6,0). Для дальнейшей очистки занной окончательной стадии, приведены в табл. 8. Таблица8 тих материалов, их концентрируют затем подвергают гельфильтрации на колонке (1,5-95 см), заполненной ефакрилом S-200, уравновешенной 0,1 М фосфатнвлм буфером (рН 7,0), содержащим 8 М мочевины и О,5 М хлористого натрия. КС-1 имеет две 1;1 подгруппы на высокомолекулярной стороне протеинового комплекса, КС-II соответствует подгруппе промежуточного молекулярного веса протеинового комплекса, а КС-111 - подгруппе низкого молекулярного веса. Пример 3. Получение и очистка компонентов. Компоненты КС-1, КС-11 и КС-111, полученные в примере 2, ассоциируют в соответствующих сочетаниях, в результате чего получают новые компоненты, стимулирующие секрецию инсулина под названием КСА-1 (ассоциация КС-1 и КС-111), КСА-11 (ассоциация КС-11 и КС-111), KCA-I11 (ассоциация КС-1, КС-11 и КС-111) и КСА-1У (ассоциация КС-1 иКС-11). Оптимальные условия получения этих веществ КСА-1, КСА-11, КСА-Г11 и КСА-1У следующие. В случае КСА-1 КС-1 и КС-111 смешивают в соотношении 5:1 в водном растворе и после установления рН 7,0 полученную смесь встряхивают при в течение более 24 ч. Для получения КСА-11 - КС-11. и КС-111 смешивают в соотношении 2:1 и после установления рН 7,0 полученную смесь встряхивсоот при в течение более 1ч.- Для получения KCA-1II - КС-1, КС-11 и КС-111 смешивают в соотношении (в расчете на протеин) 5:2:2, устанавливают величину рН 7., 6 и в течение 24 ч встряхивают при , для полу чения КСА-1У - КС-1 и КС-11 смешивают в соотношении 2:1, затем устанавливают рН 7,0 и встряхивают в течение 24 ч при . В указанных условиях все эти вещества можно получить с выходом волее 95%, однако для того, чтобы иск лючить неассоциированные вещества, полученные продукты подвергают дале гель фильтрации через колонку (1,5-95 см), заполненную сефакрилом S-200, уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором (рН 7,0), со держащим 2 М мочевины и 0,5 М хлористого натрия. Полученные таким способом компоненты проявляются при дисковом электрофорезе как отдельные соединения. Пример 4. Фармакологическо действие. 1. Определение стимулирующей секреции инсулина. Стимулирующую секрецию инсулина каждого из компонентов можно определить, измеряя реакцию животных на различные типы стимуляторов секреции инсулина, обычно для этих целей в качестве стимулятора выбирают глю козу. Используют самцов крыс Wistar (весом 130-140 г). Тестовая методика. Компоненты различной силы растворяют в физиологическом соляном растворе и по 0,2 мл каждого из этих растворов вводят внутривенно при анестезии эфиром в бедренную вену подопытных крыс. Через три дня определяют стимулирующую секрецию инсули на для каждого из веществ. Перед экспериментом крысы голодают 18-20 ч Для определения стимулирующей секреции из хвостовой вены каждой крысы отбирают О,1 мл крови, сразу после этого осуществляют внутрибрюшинную инъекцию 30%-ного раствора глюкозы в количестве 1 мл на 100 г веса, и через 15 мин снова таким же способом отбирают 0,1 йл крови. Стимулирующую секрецию инсулина определяют по разнице в уровне содержания сахара в крови и концентрации инсулина в крови до и после введения глюкозы. Уровень сахара в крови определяют по ме тоду глюкозооксидазы в концентрацию инсулина по двойному методу антител Потенциальную иммуноактивность компонентов можно определить с помощ различных экспериментальных систем. Тестовые животные: самки крыс штамма Wistar.(вес тела 200+10 г) и
30
10
КС-1
16
10 самцы крыс штамма Wistar (вес тела 250±20 г). Тестовая методика заключается в следующем, динитрофенил-аскарис (ДИФ-АС), полученный при связывании нитрофенильной группы с протеином, полученным из Ascaris suura, используют в качестве антигена. 1 мл такого антигена и различные активные вещества растворяют в О,5 мл физиологического раствора, полученные таким образом растворы вводят подкожно в подошвы как передних, так и задних .конечностей самцов крыс, находящихся под эфирной анестезией, для первичной иммунизации. Для контроля 1 мг ДНФ-АС растворяют в О,5 мл физиологического раствора, содержащего 10 погибших клеток бактерий. В.pertussis и аналогичным образом сенсибилизируют для осуществления первичной иадлунизгщии. Через 5 дней после первичной иммунизации 0,5 мл физиологического раствора, содержащего 0,5 мг ДНФ-АС, вводят в спинную мышцу крыс под эфирной анестезией, и еще через 3 дня определяют уровень содержания антител анти-ДНФ-ЛС в сыворотке. Это определение проводят следующим образом. 0,1 мл крови, полученной из хвостовой вены крысы, помещают в тестовую пробирку с 0,2 мл физиологического раствора, содержащего гепарин, и после разделения на центрифуге при скорости вращения 3000 об/мин при 4°С в течение 15 мин вьщеляют надосадочную жидкость для приготовления пятикратно разбавленной сыворотки. Уровень содержания антител в полученной таким образом сыворотке определяют, используя пассивную кожную анафилактическую реакцию по методу Тада. Уровень содержания антител в сыворотке выражают через максималь-, ное разбавление сыворотки, при котором появляются синие пятна более 5 мм, а активность промотирования выделения антител (силу) каждого препарата выражают в единицах активности, причем активность, соответствующую lCl -24-кратному уровню антител, обозначают как 1000 единиц. Удельную активность определяют путем деления единицы силы на вес. Г Стимулирующая секреция инсулина и потенциальная имлуноактивность представлены в табл. 9. Т а б, л и ц а 9 1АР - протеиновый компле Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный в соответствии с изобретением, не только действует как стимулируюишй секрецию инсулина агент у млекопитакнадх и поддерживающий уро вень сахара в крови в нормальных пределах, но также пригоден для стимуляции выделения антител и для повышения клеточной иммунности. Поскольку этот протеиновый комплекс оказывает указанные действия в чрезвычайно малых дозах, его можно использовать как лечебный или профилак тический препарат для различного рода диабетов, или в качестве лечебного препарата против заболеваний, возникающих в результате нарушенных иммунофункций (например, злокачественные опухоли, апластическая анемия, ревматоидные артриты и т.д.). Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, его составные компоненты KC-I, КС-11 и KC-1I1 и ассоциированные из них вещества КСА-1, KCA-I1, КСА-Ш и КСА-1У обладают активностью по отношению к стимулирующей секреции инсулина и потенциальной иммуноактивностью. Компоненты протеинового комплекса каждый в отдельности, облсщают слабой стимулирующей активностью секреции инсулина, а при соединении друг с другом - высокой активностью. В частности все без исключения вещества, включающие КС-111, обладают высокой стимулирующей секрецией инсулина, поэтому именно этот компонен КС-И1 играет важную роль в развитии стимулирующей секреции инсулина. Побочные эффекты и токсичность. Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию инсулина, выделенный и очищенный, обладает высокой стимулирующей активностью секреции инсулина в чрезвычайно малых дозах и поэтому может быть с высокой эффективностью использован для лечения и предотвращения различных видов диабетов. Одна ко этот протеиновый комплекс облада также целым рядом побочных эффектов
Продолжение табл. 9 стимулирующий секрецию инсулина, таких как повышение содержания лейкоцитов и восприимчивость к гистамину. jKpoMe того, отмечена сильная антигенность комплекса. Эта антигенность столь высока, что может вызвать анафилактический шок при втором и последующих введениях. Вещества КСА-1, КСА-11, KCA-1II И КСА-1У, полученные в результате образования из уже разделенных компонентов протеинового комплекса, обладают заметно пониженными побочными эффектами. В частности, КСА-1, хотя практически и соответствует протеиновому комплексу по стимулирующей секреции инсулина, отличается в 50 раз меньшей активностью в плане повышения содержания лейкоцитов, в 10 раз меньшей активностью в плане повышения чувствительности к гистамину и в 30 раз меньшей антигенностью по сравнению с комплексом. Острая токсичность LDjQ продуктов из этих веществ соответственно понижается. Протеиновый комплекс, стимулирующий секрецию и-нсулина, вызывает изменение чувствительности к гистамину и активность и промотировании лейкоцитоза, а также высокую антигенность в чрезвычайно малых дозах. Компоненты КС-Г, КС-11 и КС-П1 протеинового комплекса обладают обычно более чем в 10 раз низшим уровнем побочных эффектов, чем сам комплекс. В частности, KC-I и КС-11 практически не дают побочных эффектов, однако, КС-11 в заметной степени провоцирует эти побочные эффекты. Ассоциированные вещества обычно гораздо слабее с точки зрения побочных эффектов, чем протеиновый комплекс . В частности, КСА-Г вообще не обладает побочными эффектами, даже при введении в десятикратной дозе, что связано с отсутствием в нем КС-11, который и является ответственным за побочные эффекты. Острая токсичность LDjQ (мкг/кг живого веса) протеинового комплекса, стимулирукицего секрецию инсулина.
его компонентов КС-1, КС-11 и КС-И1 и их ассоциированных веществ КСА-1, КСА-1, отличаясь высокой активностью промотирования секреции инсулина, обладает и другими полезными в фармакологии действиями, такими как улучшенная толерентность глюкозы повышенная реакция секреции инсулина способствует лечению диабетов, вызванных стрептозотоцином и улучшает устойчивость толерантности глюкозы при наследственных диабетах. Эти активности поддерживаются в- течение от нескольких недель до нескольких месяцев после одного приема вещества. Предлагаемые вещества могут быть применены в качестве лечебных препа ратов для д:иабетиков. В настоящее ;время лечение диабетов основано на инъекциях инсулина или оральном при еме антидиабетических препаратов, однако они представляют собой прост препарат для лечения симптомов. Кроме того, пациенты должны каждый день посещать больницы для инъекций инсулина, прием антибиотических пре паратов заключает в себе опасность вызвать ненормальное падение уровня сахара в крови. Протеиновый комплек
КСА-И, KCA-ill и КСА-1У приведена в табл.10.
Таблица 10 стимулирует секрецию инсулина, но также обладает способностью повышать концентрацию инсулина в крови только тогда, когда уровень содержания сахара в крови уже поднимается под действием различных-условий (накопление глюкозы в условиях повышенного уровня содержания сахара в крови, например во время приема пищи), и быстро снижает повышенное содержание сахара в крови до нормального уровня. Кроме того, предлагаемое вещество сохраняет активность в течение от нескольких недель до нескольких месяцев после единственного приема. Поэтому, когда снижается реакция секреции инсулина на уровень сахара в крови, приём этого вещества вызывает нормальную активность секреции инсулина. Благодаря этим свойствам, вещество находит широкую сферу для применения, т.е. оно не только полезно в качестве лечебного препарата для диабета/ но и является эффективным в применении на предшествующей диабету стадии заболевания,или в качестве предотвра-. щающего, лечебного иди диагностического препарата для начальной стадии диабета.
