Способ получения антибиотического комплекса Советский патент 1977 года по МПК C12D9/14 

ность №1целия частично тонко покрыт инеем, кристаллы тироэйна не раство ряет. Физиолого-бирхимические признаки Растет при 20-40 С оптимум рост Отношение к источЕникам углерода Усваивает крахмал, декстрин, сахаро зу, мальтозу, глюкозу, лактозу, сор бит, глицерин, Молоко пептонизнрует. Образует меланин с Спойоб получения антибио сика J.K лючае.тся в том, что штамм .Дс1}йо( jBeanes SI.-73/B и/или &11яорйзпв8 S -73fa выращивают на питательной среде с держащей источники углерода, азота и минеральные соли при 20-40 С и рН 6,0-8,0 с послёдукнцим ВБщеление антибиотического комплекса и разде лением его на антибиотик Аи Б 1. Культивирование Мицелий штамма, выращенный ца ск шенном агаре состава, вес.%: Пептон .0,2 Казеин-гидролизат, кислый к, . О л (f X. Нейтральный многоатомный спирт, МП «Тростниковый сахар Агар Вода водопроводная ДО 100 помещают в литровые колбы Эрлёнмей ра с посевной средой следующего со тава вес«%1 Соевая мука, обезжиренная3Глицерин повшаенной чистоты3 ,-г Вода водопроводная до 100 С целью пеногашения в среду добавляют нейтральный многоатомный спирт в количестве 1 капля на 140 питательной среды и культивируют в течении 8 дней на качалке при Ферментационная .среда имеет сле дующий состав, вес.%5 ДекстринOf 4 Глицерин0,2 Дрожжевой экстракт 0,2 ,2 В.одопроводная вода до 100 Нейтральный многоатомный спирт, спирт, мл5 8 л среды переносят в стеклянные ферментеры с мешалкой и с установкой ля аэрации С помощью едкого натрия устанавливают значение рН 6,8 и при -120 С стерилизуют. После охлаждения растворов в ферментеры приливают по 240 МП выращенных на посевной питательной среде культур mxaMivia Jicti«ofteanes SE-73 : и подвергают аэрации с помощью 1 л воздуха/мин при 600 об, мешалки в 1 мин и выдерживают при . По истечении 17 и 24 ч после начала культивирования добавляют в ферментеры 0,4 % декстрина, 0,2% глицерина и 0,3 % дрожжевого экстракта и по истечении 30,41 48 и 50ч 0,4% декстрина, 0,2% глицерина и 0,4% дрожжевого экстракта в виде концентрированных смесей этих компонентов в объе1ме по 200 мл/добавку. Повышение объема вследствие этих добавок коспенсТируется испарением воды. Общее количество компонентов питательного раствора составляет 2,8 % декстрина, 1,4 % глицерина, 2,4 % дрожжевого экстракта и 0,2% СаСОу. По истечении 120 ч культивирование заканчивают2 о Выделение антибиотика А Полученную культуральную жидкость из пяти ферментеров (5x8 л) соединяют, добавляют 48 л ацетона, перемешивают при в течение 1 ч к затем центрифугируют, прозрачный, освобожденный от мицелия нативный раствор сгущают до приблизительно 35 л в вакууме при 20-35с едким натром, устанавливают значение рН 9 и экстрагируют с помощью 18 л этилацетата. Органическую фазу сушат с помощью 500 г сульфата натрия, в вакууме упаривают до 1 л и добавляют 2 л циклогексана. Отфильтровыванием выпавшего осадка получают после сушки на воздухе 12,5 г сырца антибиотика А. Зо Очистка антибиотика А а)1,00 г сырого антибиотика разделяют на 20 пластинках из силикагеля (20x20 см) с использованием в качестве растворителя смеси хлороформа, метанола и 25%-ногЬ водного раствора аммиака в отношении 40:6:1 (по объему), Изолируют главную зону с коэффициентом J г 0,34. Выход 327 мг антибиотика. б)3,5 г сырого антибиотика подвергают ..роматографии на колонке длиной 100 см и диаметром 5 см, наколненной нейтральным силикагелем (силикагель 60, величина зерен ниже 0,063)

и в качестве растворителя используют смесь хлороформа, метанола и 25 % водного раствора аммиака в соотношении 40:6sll.

Улавливают абсорбирующую при 307 и главную фракцию, Элюат упаривают в вакууме и остаток переосаждают из- этилового эфира уксусной кислоты / петролейного эфира. Антибиотик сушат в течение 4 дней при 100с в высоком вакууме при 0,01 тсрр. Выход 1,8 г антибиотика.

в) 50 г сырого продукта подвергают распределению методом Крайга- в смеси растворителей из петролейного эфира, уксусного эфира, диметилформамида и воды в соотношении 1,5;8,5:5:5 (по объему),

Проводят 80 приемов распределения, причем после шестидесятого приема фракционированно отбирают верхнюю фазу. Антибиотик находится в фракциях 21-68. Улавливаемую верхнюю фазу промывают водой, упаривают в вакууме и добавляют 100 мл этилового эфира уксусной кислоты. Добавлением I л диэтилового эфира выделяют антибиотик, отфильтровывают и в высоком вакууме сушат при 100С и 0,01 торр в течение 4 дней. Выход 17 г антибиотика,

4. Выделение антибиотика В,

Полученную согласно п.1 культуральную жидкость из пяти стеклянных ферментеров (5x8) соединяют, добавляют 48 л ацетона, перемешивают при в течение 1 ч и затем центрифугируют. Прозрачный освобожденный от мицелия нативный раствор сгущают в вакууме при 20-35 0 приблизительно до 35 л, едким натром устанавливают значение рН 9 с помощью 18 л этилацетата .экстрагируют. Органическую Фазу выкидывают, значение Н водного раствора после насыщения поваренной солью устанавливают 8,5 и дважды экстрагируют с помощью 9 .л этилацетата. Водную фазу выкидывают и органический раствор сгущают в вакууме до 1л, Из этого раствора выделяют сырой антибиотик с помощью 3 л нормального гексана. Осадок отсасывают, промывают небольшимколичеством простого эфира и, размешивая, подгиот в воду, причём с помощью 10%-ного содого раствора поддерживают значение рН- 7,3. Лиофилизацией получают из этого раствора 10,5 г сырого антибиотика В. 5, Очистка антибиотика В.

а) 1,00 г сырого антибиотика В Разделяют на 20 пластинок из силикагеля (20x20 см) с использованием в качестве растворителя смеси хлороформа и метанола в соотношении 5:1. Изолируют проявляющуюся под УФ-лампой верхнюю зону. Выход 344 мг антибиотика. .

б)10 г сырого антибиотика растворяют в 600 мл бидистиллированной вод и подвергают фильтрации через находящийся в колонке длиной 70 см и диамером 5 см ацетилированный поликапролактам. Улавливают абсорбирующие при 67 мн фракции. Главную фракцию экстргируют хлороформом, хлороформенный раствор упаривают и остаток сушат в течение 4 дней при 60 С и 0,01 торр. Выход 5,2 г антибиотика.

в)Полученный 1 г сырого антибиотка растворяют в 100 мл ацетона. Центрифугируют и к раствору добавляют п порциям 17 мл циклогексана. Центрифугируют и осадок сушат в вакууме при 100 С и 0,01 торр. Выход 182 мг.

Таким образом найдено что новые антибиотики можно получать,если штаммы ActmopEanes SE-73 t или SE-73/B отдельно или совместно культивируют в питательной среде и антибиотик известными методами изолируют из питательной среды.

Кроме того найдено, что новые антибиотики имеют сильное антимикробиологическое действие и наряду с тем имеют свойство ускорить или способствовать росту животных и улучшит использование корма животными.

Новый антибиотик А характеризуется следующими химическими и физическими свойствами.

Найдено, %: С 56,19; Н 6,54; О 37,25; 4 ОСИ, 7,9.

Cfff xff

Вычислено, %: С 56,40; Н 6,54; О 37,05; 4 ОСН 7,8.

+) по истечении 4 дней в высоком вакууме при ЮОс.

Точка плавления:

Начиная с приблизительно 14 2с вещество подвержено легкому разложению начиная с - сильному разложению. При скорости нагревания приблизительно 5с/мин в области 196-205 С наблюдается процесс плавления.

,Специфическое вращение: Wi -6,б (с 1,0% в метаноле) .

Молекулярный вес «570 - 1630.

Ультрафиолетовый спектр поглощения:

jlx-o-j/c 307 нм (с 0,0106% в метаноле) 307 нм 351

.Инфракрасный спектр поглощения.

Максимальные частоты поглощения в ИК-спектре (Квч): 2980, 2940, 2900, 1710, 1450, 1415, 945, 905, 870, 840, 820, 785, 750, 735, 700 см

Антибиотик А хорошо растворим в хлороформе, ацетоне, этиловом эфире уксусной кислоты, ацетонитриле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде и низших спиртах, например метаноле, этаноле, менее растворим в воде, диэтиловом эфире, петролейном эфире и циклогексане. Антибиотик А является аморфным бесцветным нейтральным веществом, ко торое при электрофорезе не мигрирует При сильном кислом гидролизе отщепля ются различные восстанавливающие сахара (например, с помощью водной 10 вес.% серной кислоты 80 С). Коэффициенты Pf антибиотика А на нейтральный пластинах с гелем кремневой кислоты в различных растворите лях: Хлороформ:метанол - (90:1) 0,27; Хлор6форм:метанол:25%-ный водный раствор амкшака (40:6:10) 0,34; Метанол 0,83; Бутанол:ледяная уксусная кислота вода (60:20:20) 0,55. - Антибиотик Б может быть охаракте ризован следующими свойствами: Элементарный состав С,. Н Ojg /% С 50,8; Н 7,2; О 42. Молекулярный вес 1340-1390, Ультрафиолетовый спектр поглощенияЛ, jutrjfc а 265 нм (С 0,0091% в метадоле) 265 нм 164. / Инфракр,сный спектр поглощени Максимёшьныё частоты поглощения в ИК-спектре, КВч: 2960, 2920, 2850 1630, 1445, 1405, 1375. 1200, 985, 940, 905, 780, 750 см Характерным для молекулы являетс чувствительность к кислотам. При зна чении рН 2 и комнатной температуре 18-22с антибиотическая активность в течение 1 ч уменьшается до О. Одновременно исчезает характерная полоса в Уф-спектре при 267 нм. Щелоками также антибиотик В разлагает Антибиотик В является нейтральным еществом, которое при электрофорезе не мигрирует. При киислом гидролизе (например, с помощью водной 10 вес.% серной кислоты при ) отщепляются восстанавливающие сахара. Коэффициенты антибиотика В на пластинах с гелем кремниевой кислоты в paзличj ыx растворителях: метанол:хлооформ (4:1)-0,49, н-бутанол:ледяная уксусная кислотагводс (60:20:20)-0,47. Предлагаемые антибиотики эффективны против стафилококков, стрептококков, нейсерий, коринебактерий, микробактерий, сальмонелл, шигел, вибрионов, спорообразующих бацилл, клостридий, протея. Предлагаемые антибиотики обладают незначительной токсичностью и могут быть применены в медицине и ветеренарии для лечения заболеваний, вызываеbttjx перечисленными возбудителями, а также в качестве средства, способствующего росту животных. Предложенные антибиотики новые и в научно-технической и патентной литературе не описаны. Формула изобретения Способ получения антибиотического комплекса, о т л и ч а ю щ и Jl с я тем, что штамм Actinojoeonea SE-73 и/или Jteti«oioEaneaSS-73B выра1цивают на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при 20-40 С и рН 6,0-8,0 последующим вьвделением целевого продукта и разделением его на отдельные компоненты.