Способ получения антибиотика -11743/а Советский патент 1979 года по МПК C12D9/14 

I

Изобретение относится к микробйо1логической промьаяленности и касается получения антибиотиков.

Предложенный антибиотик является нов1.1 и способ егополучения не-описан.

Целью изобретения является способ получения антибиотика S 11743/А формулы

Споры гладкие, овальной формы от элиптической до цилиндрической, ширина 0,7-0,9 мкм, длина 1,33-1,50 мкм.

На среде с солодовым экстрактом рост отличный, золотисто-коричневого цвета, воздушный мицелий свинцовосерого цвета, форма мицелия - открытые спирали и загибы, растворимых пигментов нет.

Крахмал-агар-рост очень хороший, бежевого цвета, воздушный мицелий серый, открытые спирали и загибы, растворимых пигментов нет,

Овсяная мука с агаром - рост хороший, от желто-коричневого до бежевого , воздушный мицелий серебрис то-серого цвета, растворимых пигментов нет.

Среда Чапека - рост средний, от кремового до коричневого, Воздушный мицелий от белого до серого, растворимые пигменты коричневого цвета.

Глицерин-аспарагиновый агар рост средний, золотисто-коричневого цвета, воздушный мицелий светло-серый, растворимый пигмент желтый.

Глюкозо-глицериновый агар - рост хороший, золотисто-коричневый, воздушный мицелий серый, открытые спирали, 2-3 витка, растворимый пигмент коричневый.

Хорошо растет и усваивает глюкозу арабинозу, ксилозу, маннит, фруктозу рамнозу, крахмалы, галактозу, глицерин, целлобиозу, декстрин, маннозу.

Рост средний на инозите. Плохо растет и усваивает сахарозу, сорбит, яблочную кислоту, не усваивает рафинозу, целлюлозу, салицин, инулин, дульцит.

Физиологические свойства.

Восстанавливает нитраты, гидролизует крахмал, целлюлозу не разлагает тйрозиновая реакция отрицательная, молоко не коагулирует, слабо пептониэирует молоко, плохо разжижает желатину, меланин не образует.

Выращивание штамма Streptomijce 9 тиIat)i6i4 8088 осуществляют аэробным и иммерсионным способом.

Для получения антибиотика S.-11743/А предпочтительно применяют вегетативную форму штамма для инокуляции продуцирующей среды.

Для этого сначала получают вегетативный инокулят микроорганизма путем инокуляции небольшого колич ества куль уральной среды суспензией спор шталала Streptom ces wotabiCis NRRl/ 8088. Часть мицелия в культуральном бульоне переводят в р.астворимую -форму, разлагают и соединение Получают известным образе с помощью экстракционных или абсхзрбционных методов, но также можно сначала отцентрифугировать лшцелий от культурального бульона, фильтрат культуры и мицелий .после расйределения экстрагируют раз643085

дельно и экстракты обрабатывают далее по отдельности или объединив их. Антибиотик 5 -11743/А выделяют предпочтительно в форме соли, причем солей щелочных металлов, щелочноземельных металлов или аммония, Антибиотик S-11743/А в форме его аморфной и содержащей ацетон, кристаллической натриевой соли и кристаллической калие1вой соли обладает следующими свойствами.

- Элементарный состав аморфной натриевой соли.

Вычислено, %: С 63,4; Н 9,0; N2,9 О 24,7. С Hg, Na

Найдено,: С 63,5; Н 9,1; N3,2; о 24,1.

Т.пл. аморфной Na-соли 166-169°С, кристаллизованной с. ацетоном Ма-соли т.п 159-163°С| удельное врамение в метаноле +83,5 (С 1,0) в хлороформе + 106,2° (С «1,0) Ма-соли хорошо растворимы .в органических растворителях, таких как толуол-, бензол, хлористый метилен, этилацетат, изопропилацетат, этанол, метанол, в воде соли плохо растворимы.

Калиевая соль антибиотика ё 11743/А имеет элементарный состав

4 69iz Вычислено,: С 62,1; И 8,8;

О 24,2.

Найдено,: С 61,9; Н 8,9; К О - не определяли.

Т.пл. 3:58-1бОс.

Удельное вращение метаноле + 89,1° ,98) .

хлороформе +102,0°(С 1,10) .

Антибиотик S -11743/А можно использовать в качестве лечебного с редства, он обладает, антибиотической активностью против таких шкроорганизмов, как грамположительные бактерии и грибы.

. Антибиотик- И743/А и его физиологически cosMQCTHNsae соли могут ть использованы при острой сердечной недостаточностя, для шоковой терапий, а также для лечения коронарянх заболеваний.

Антибиотик S 11743/й в киолоты или ее солей можбт применяться

.в медицине в качестве лекарственного средства в чистой фориё или s соответствующей лекарственной фор«е для внутривенного, энтерального иля парентерального ,

Пример 1. Культурайы/увв bjpe дУ следуняцего состава г/Я1

Церелоза, ((глюкоза) 4,0 Соподо Й экстракт 10,0

2оо°

Дистиллированная

1 л

вода инфицируют приготовленной суспензие спор первоначально выделенного штам Streptomvces mutafeiRls i«iRRl 8088. среде перед стерилизащиёй с пом щью МаОН устанавливают рН 8,3-8,6. После стерилизации (20 мин при темп ратуре 120С) устанавливают рН 6,97,3. Хорошо спорулирующую агаровую ку туру штамма смешивают с Ь мл стерил ного, 0,9%-ного раствора поваренной соли, что дает густую суспензию спо Из этой суспензии спор 1 мл применяют для инфицирования колбы Эрле мейера емкостью 500 мл, которая содержит 100 мл следующей среды предй рительной культуры, г/л; Pfrarmamediq 25,0 Церелоза (глюкоза)25,0 (среда Дистиллированная вода1л рН 6,5-6,8 Среду предварительной культуры стер лизуют в автоклаве при температуре 120С в течение 20 мин, рН 6,7-7,2. После этого предварительную куль туру аэробно инкуб.ируют в течение . трех дней при температуре и затем применяют для инфицирования основной культуры. Для этого 5 мл предварительной культуры помещают в колбу Эрленмейера емкостью 500 мл со 100 мл следующей среды, г/л: Сахароза Пептон Солодовый экстракт Дрожжевой экстракт 2,0 (среда I КН РО 2,0 MaSO./HjO 2,0 Дистиллированная рН 6,8-7,2 устанавливают с помо щью NaOH. Основную культуру инкубируют в течение 6 дне,й при на круговой качалке при 200 об/мин. Пример 2. Культуру штамма Streptom ces motabieis WRKL 8088 получают путем выращивания в течени 10 дней при температуре 27с н.а сре де III. Споры и мицелий этой культур обрабатывгиот в физиологическом раст воре поваренной соли. С помощью это суспензии заражают 1 л следующей среды, г/л: Растворимый крахмал30,0 Глюкоза20,0 Мука соевых бобов10,0 Corn Steep10,0 Полипептон5,0 Косе3,0 ,0 Дяотиллярованная вода1л рН 7,О устанавливают с помощью NaOH. Эту предварительную культуру иякубируют в течение 3 дней при температуре 27°С на круговой качалке при 180 об/мин. .1.0 Л питательной среды П заражают предварительной культурой и инкубируют в стекля21нрм, ферментере при перемешиваний npif 2Оо об/мин и аэрации воздуха 1 л/мин в течение 5 дней при температуре 27с. Пример 3. Выделение натриевой соли антибиотика 100 л культурального бульона, полученного по примеру 1 и 2, центрифугируют,, причем выделяется примерно 90 л фильтрата культуры и примерно 6 кг мицелия. В культуральном фильтрате устанавливают рН 9 с помощью 1 н.раствора гидроокиси натрия и фильтруют до прозрачности через вспомогательные фильтры i Фильтрат при температуре трижды экстрагируют этилацётатом и экстракты промывают 15 л воды. После выпаривания органической фазы в вакууме при температуре 2040С выпадает примерно 16 г сырого экстракта. Мицелий экстрагируют сначала 12 л метанола, затем дважды по 12 л смеси метанол: вода - 9:1, в течение 1 ч при 20-25°С при одновременной гомогенизации. Материал клеток затем отфильтровывают. К фильтрату добавляют 5 л воды, выпаривают в вакууме при температуре 2О-4О с до объема Зле помощью Iн.раствора гидроокиси натрия устанавливают рН 9. Трижды экстрагируют по 3 л этилацётатом, экстракты промывают 1,5 л воды и органические фазы выпаривают в вакууме при температуре 20-40 0. Выделяется 9,4 г экстракта. Оба экстракта объединяют, обрабатывают 500 мл воды и экстрагируют трижды по 250 мл толуола. Толуольную фазу промывают один раз 100 мл воды, высушивают над сульфатом натрия и выпаривают в вакууме при температуре 40с. Выделяется IIг желтого, маслянистого остатка. Этот остаток хроматографируют на силикагеле 60 Merle с величиной зерен 0,06-0,2 мм. Используют смесь толуол-ацетон 98:2 +1% триэтиламина. Элюирование смесью толуол:ацетон 98:2 +1% триэтиламина и смесью толуол:ацетон 9:1 +1% триэтиламина дает преимущественно неактивные примеси (сопутствующие вещества). С помощью смеси толуол:ацетон - 4:1 и толуолацетон 1:1 при добавке 1% триэтиламина элюируется антибиотик в обогащенной форме. Фракции выпаривают в вакууме при температуре 20-40 с и остаток хроматографируют на содержани е антибиотика S 11743/А. Активные фракции объединяют и снова хроматографируют на 40-кратном количестве силика-геля, причем применяют хлороформ с увелйченнь1м содержакйем метанола для элюйрования. Смесью хлороформ:метано 9В:2- элюируют антибиотик .5 11743/А D сильно обогавденнсй форме. После выпаривания активных фракций в вакууме при температуре 20-4ос светло жёлтый остаток растворяют в хлороформе , один раз твс-гряхиваюг с 1 н.ра створом едкого натра/ органические фазы промывают водой, вьтаривают в вакууме и остаток кристаллизуют из 1,5-кратного количэства ацетона. Выделяется натриевая соль антибиотика 11743/А в виде бесцветных ji-одержащих auetpH кристаллов с т.пл. 159-1бЗ С. Для удаления кристаллизационного ацетона многократно обрабатывают в вакууме бензолом и затем метанолом. Аморфную, Чистую натриевую соль антибиотика S 11741/л высудавают в вакууме при температуре и затем плавят при 166- 1б9с. Пример 4, Кал11евая соль антибиотика S 11743/А. 280 мг натриевой соли антибиотика $ 11743/А растворяют и 40 мл хлороформа й встряхивают отличающийся тем, что штамм Streptomsces motatiKis N4Tl 8088 в фацивают на питательной среде,соде жАцей источикки азота/углерода и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта в виде кислот или соли. дважды по 40 мл с 2 н.соляной кислотой и промывают 40 мл воды. Органическую фазу со свободной кислотой антибиотика в И743/А встряхивают (дважды по 40 мл) с 2 н. КОН и один раз промывают 40 мл воды. Хлороформную фазу высушивают над твердым карбонатомкалия и после фильтрования выпаривают в вакууме. Остаток растворяют в 2 мл метанола и фильтруют через тальк. Через 4 ч кристаллизат отфильтровывают и перекристаллиэовывают из 2 мЛ кипящего метанола. После стояния в течение ночи отфильтровывают и остаток высушивают в вакууме при температуре 4ОС в течение 1 ч. Получают бесцветные кристаллы калиевой соли с т.пл. iSS-ieo C, Предлагаемый антибиоти облгадает антибиотической активностью против таких микроорганизмов, как грамположительные бактерии и грибы. Формула изобретения 1. Способ получения антибиотика формулы . ««.f«fi 2. Способ по п.1, о т л и ч а юQt и и с я тем/ что вьфащивание штамма осуществляют на питатвльнМ cipefli&f содержшцей дополнительно микроэлементы;.