Способ получения антибиотического комплекса лизолипина Советский патент 1979 года по МПК C12D9/00 

Цепи спор разветвлены моноподиально и имеют форму тесных равномерных винтов, которые в большинстве случа имеют не более чем 3 витка. Споры эллипсоидны, их ширина примерно О,9.нм и длина примерно 1,2 нм;пове ность ровная. При росте на содержащих пептон питательных средах (пеп-тонжелезный агар) после инкубации в течение нескольких дней не наблюдается меланоидного изменения цвета. Штамм, таким образом, не показывает хромогенности, так как он не может образовать тирозиназу. Антибиотик лизолипин получают, выращивая при аэробных условиях шта Streptomyces violaceaniger Tii 96 или образующий лизолипин мутант этого штамма в водном питательном раствора, содержащем источник, углерода и азота, а также неорганически соли, пока питательный раствор не покажет значительное антибиотическое действие, и выделяя потом антибиотик лизолипин из культурального фильтрата. Образующие антибиотик танты можно получить, например, . при воздействии ультрафиолетовых ил рентгеновских лучей или азотистой горчичных масел-. в качестве источников углерода и прльзуют, например, ассимилируемые углеводы, например, глюкозу, сахаро ру, лактозу, маннит, крахмал, глице рин i В качестве содержащих азот питательных веществ используют аминокислоты, пептиды и протеины, атакж продукты их разложения, например пе тон или триптон, или мясные экстрак ты, водорастворимые доли злаковых зерен, например кукурузы и пшеницы остатков от перегонки при изготовле НИИ алкоголя, дрожжей, бобов, в частности соевых семян, например, хлопчатника и т.д а также аммониевые соли и нитраты. Питательный ра створ может содержать ещё другие неорганические соли, например хлориды, карбонаты, сульфаты, фосфаты щелочных или щелочно-земельных металлов, магния, )йелеза, цинка и марганца. ВЫраидивание проводят в аэробных условиях, например в п6 коящейся поверхностной культуре, или, предпочтительно, под водой при взбалтывани или перемешивании с воздухом или кислородом в качалочных колбах или известных ферментерах. Пригодная те пература 18-40°с, предпочтительно 27°С. Значительное антибиотическое действие питательный раствор при э в общем показывает через 3-7 дней. Предпочтительно проводят выращивани в некоторых стадиях, т.е. сначала приготовляют одну или некоторые предварительные культуры в жидкой питательной среде, которые потом пересеивают в собственно продуцирующую среду, например, при соотношении 1:20. Предварительную культуру получают, например, путем пересева, полученного примерно 14-дневным выращиванием на питательной среде мицелия со спорами в жидкую среду и оставляют расти в течение 72 ч. Антибиотик содержится в культуральном фильтрате. Выделение антибиотика из культурального фильтрата осуществляют по общеизвестным методам, учитывая химические, физические и биологические, в частности, липофильные свойства антибиотика. Из культурального фильтрата можно экстрагировать антибиотик не смешиваемым с водой липофильным растворителем, например уксусным эфиром, углеводородами, такими как циклогексан, бензол, или галогенированными углеводородами, например метиленхлоридом, хлороформом, тетрахлорметаном, тетрахлорэтиленом. Для очистки получаемого после упаривания растворителя сырого продукта можно использовать, например, экстракцию, осаждение, распределение между несмешиваемыми фазами растворителя, или адсорбцию, прежде всего хроматографию. Большую долю более липофильных примесей можно удалять путем экстракции сырого продукта петролейным эфиром. Можно также растворять сырой продукт, например, в метаноле и вьщелять от примесей при помощи адсорбентов, например активного угля, силикагеля, силиката магния, окиси алюминия или их смесей,, или адсорбирующих смол, например сшитых декстранов, таких как Сефадекс. Сырой продукт можно очищать, например, путем повторной колоночной хроматографии с применением силикагеля, целесообразно с незначительными добавками активированного угля. Антибиотик элюируют предпочтительно по градиентному способу при помощи смесей хлороформа или тетрахлорметана и метанола, прич-ем ступенчато повЕэпиают процентное содержание более полярного растворителя. Вышеуказанное распределение между несмешиваемыми фазами растворителя можно также осуществлять при помощи противоточного распределения в аппаратуре Крейга. Системой растворителей служит, например, смесь хлороформа, циклогексана, метанола и воды. Для получения отдельных однородных компонентов антибиотика их разделение и выделение можно осуществлять, например, по методу препаративной тонкослойной хроматографии.

Более предпочтительным является разделение при помощи колоночной хроматографии, причем в качестве адсорбента применяют, например, силикагель с содержанием 1-5% активированного угля, а элюирование предпочтительно проводят по градиентному способу при помощи смеси хлороформа и метанола. Повьицение концентрации менее полярного растворителя целесообразно проводить в маленьких процентных степенях, например 5-20%, хлороформа. Можно работать по непрерывному методу градиентного элюирования. Процесс очистки в соответствующем случае можно повторять.

В тонкослойной хроматограмме на плитках силикагеля (силикагель 60, 254) компоненты показывают следую5 щив величины в хлороформе - метаноле (9:1) : X 0,58, 1 0,81, в бензоле метаноле (9:1) : X 0,26, 1 0,30 в хлороформе ацетоне (5:5) j X 0,40, 1 0,53; в бензоле - ацетоне (5;5) : X 0,47, 1 0,74. Для лиэолипина (I) в опыте серийного разбавления были найдены следующие минимальные концентрации торможения (МКТ).

Таблица 1

Дпп лизолипина (X) МКТ повышается на фактор 10-50.

Компонент (I) лизолипина имеет следующие химические и физические свойства.

Он представляет собой темно-жел-. тое кристаллическое вещество, которое практически нерастворимо в воде и водных кислотах и основаниях, в низших алканолах, например метаноле.

этаноле, н-пропаноле, а такжев эфире и петролейном эфире, где оно частично растворяется. Оно хорошо растворяется в ацетоне, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, уксусном эфире, углеводородах, например циклогексане, бенэоле и галогенированных углеводородах

Лизолипин (1) плавится после кристаллизации из ацетона-эфира при 260-262С с разложением о ff -50,2 (хлороформ). При тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе хлороформ-метанол {1-9:1), Rf составляет 0|6. Элементный анализ: Вычислено, %: С 58,25; Н 4,05; СЕ 5,93; N 2,34,3; ОСИj 15,57. С29Н24СеНО (597,95) Найдено, %: С 58,36 - 58, 30; Н. 4,22 - 4,27; СЕ 6,03; N 2;4&-2,38; OCHj 15,43. (ОСНз - определение по Цейзелю).

Молекулярный вес, определенный осмометрией давления пара в этилацетате, составляет 536. Микротитрация с 0,1 Н гидроокисью третраметиламмония в метилцеллосольве-воде (8:2) дает эквивалентный вес 545. Титрация с 0,1 Н..НС - нет ступен (таким образом, атомазота не является основным).

Лизолипин (I) имеет по меньшей мере две ацилируемые гидроксильные группы. Путем более длительного ацетилирования (2 недели при комнатной температуре) получают ди-0-ацетил-лизолипин (1)t который кристаллизуют из ацетона-воды. Получают светло-желтые кристаллы в форме призам с точкой плавления 216-224°С.

Если аЦилирование проводят тольк в течение ночи, как обычно, то получают смесь двух продуктов, очевидно моно- и полиацетат, которые не удается разделить путем кристаллизации В масс-спектре этой смеси сигналы появляются при 683 и 681 мае. ед. со значительно уменьшенной интенсивностью. Путём рентгеновской спектрометрии для компонента I лизолипина была найдена следующая структурная формула

ОСИ,

Cll50 if- 0 СН,

Лизолипин (х) получают в виде бес цветного аморфного порошка. Он образует лизолипин при нагревании или при облучении ультрафиолетовым светом, в частности, в присутствии каталитического количества кислоты. 0н очень неустойчив в загрязненном состоянии, при хранении на воздухе , в частности при комнатной или повышенной температуре. Не будучи защищенным от влияния света, он постепенно превращается в лизолипин 1, Частичного разделения лизолипина (X и I) можно достигнуть распределением в системе тетрахлорметан-хлороформ-метанол-вода (3,4 : 2,28:4:1 Полученный таким образом почти бесцветный аморфный Порошок лизолипина можно перекристаллизовывать из мтанола. Он разлагается при нагревании, начиная с 230 С, и имеет оптическое вращение -- -3490 ± 1 (с 1,19 в СНСЕз). Полученное таким образом чистое соединение устойчиво в отсутствии света и кислот. Масс-спектрографический анализ показал, что соединение имеет тот же молекулярный вес и ту же эмпирическую формулу, что и лизолипин (I) и таким образом является изомером лизолипина (I). Для лизолипина (X) определена следующая структурная формула

ОСИз -С1

СИчО

В Тонкослойной хроматогра№/1е на силикагеле в системе хлороформаметанола (39:1) Rf 0,22 (Rf лизолипина (I) 0,39).

Лизолипин и его производные, кроме антибактериального действия, обладает также незначительным действием по отношению к тдрожжеподобным грибам, например Candida aEbicoms, Candida EipoEytica u Saccharamyces cerevisiae. Он действует как против растущих и покоящихся лдакробных клеток, так и против их

сферопластой. Его действие основывается на торможении синтеза клeтoчp oй стенки. Действие отчасти устра1 яется избытком липидов, например сфинголипидов, фосфоглицеридов, липидов

клеточных стенок бактерий.

Лизолипин и его производные можно применять как таковые или вместе с другими тормозящими синтез клеточной стенки антибиотиками, например пенициллинами, пефалоспоринами, циклосерином, для борьбы с инфекциями, вызванными бактериями вышеуказанного рода, а также в качестве дезинфицирующих средств. Наблюдается синергитическое действие с некоторыми антибиотиками, например пенициллинами. Для получения фармацевтических препаратов антибиотик можно персмаш аать с подходящим для топического, энтерального или парентерального пр менения неорганическим или органическим наполнителем. Применяют таки вещества- которые не реагируют с но вым соединением, например желатину молочный сахар, крах.мал, стеарат магния, растительные масла, е екзило спирты или другие наполнители лекарств. Фармацевтические пре-паратг-а Могут, например, иметь вид таблк- . ток, драже, порскака, суппозиториев г или например, растворов,, суспензий эмульсий, кремов или мазей. В соответствующем случае они стерилизованы и/или содержат всгю.мсьгз-тальные вещества, например коксерванть, ста билизаторыс смачиватели или знульга ,торы. Они могут также содержать еще другие терапевтически ценные .«ещест saa Дезинфицирующие вещества молшо также известны. образом перемеизивать с подходяа0-}1 ди наполнителями Изобретение поясняется нижесггедующими примераГШ. Пример .1 Лиоа1.шулу с 5 мл суспензии спор S« vio aceaniger Tii 96 суспендируют в 5 мл 0,2 М фосфат ного буфера с рН 7. В три колбы Эрленмейера с одной отбойной .регородкойр содержащие по 100 мл тательного раствора, который в свою очередь, на 1 л водопроводной во.оэсодержит 4 г дролскевого экстракта10 г солодового экстракта к 4 i глмтсозы и рН которого до стерилизац доводят до 7,3 при помощи 1 н раст вора едкого натра, прививают по 2 мл суспензии Streptorayces и инкуоиругот Е течение суток на вращающейся вибрационной машине (скорость вращения 250 об/ьшн) при , К 25 полученной таким образОхМ культуррл в б колбак Эрленмейера емкостью 2 ,п с 4 отбойными перегородками лрйвиBtiiOT 500 мл вышеуказанного питательного раствора. Колбы затем при 27° С HHKytSHpjfioT на. зравдагощейся вкбрац.иокной мелмке (скорость врадцения 3.20 обДгии) в течение. 48 час-, 0,75 л культуры переносят i-i фер™ мег-5тер емкостью 50 Лр содержащий 30 л вышеуказанного питательяого раствора f и .инкубируют Б эгечение суток при , Потом 15 л культуры переносят в ферментер .300 л . указанного питательного раст.аора, УС.ПОБК.Ч выращивания в ферментере давление 0,5 ати, счокость перемецшБвния 450 об/ми:-5, reMOv-zpaTypa . расход воздуха 1 л/мин.-, Опти.аль.ное образовакке антибиотика лизолипина ПРОИС.ХОДИТ примерно после интсуба-ЦИК в 100 час. Культур ал ьный раствор HMOST рН 7,5, Он в опыте диффузии в агар BaciCCus subtlEis показывает лону подавления в 14- П р к м ар 2, 600 л полученного по примйру Г культурального раствора фильтруют с прибавлением 2% ФильтроБ 1.пьр.ого вспомсгате.пьного вешестна дизтомоной зем.пи, 560 -л культурального фильтрата доводят до рк 9 при помощи раствора едкого изтра и кд негтрерывном экстракторе ги-сстрагнруют я-иксцы хлороформом в соотношении 2:1s Неактивный водный сафииат выбрасывают 600 л х.поро фазь5; концентрируют в вакууме- Получают 290 г сухого остатка иго днг-еркруют 2 л петролейного эфира , HeaKTSiBHHH летролейно-эфкрный зкстракт пс орасквают и нерастворимую часть 5зксу :::йрают s вакууме OcTa йтся 46 г -й.чго-коричкевого полуткэр-дсго ос::г.тта. npKj.iep 3. 2fSr попучен О.г- по примеру 2 сырого хтэоматографкрукгх на. колонке Сефа.пекс LH--.20 (.злкн.пйрованный сшитьй лекстраггэ) , апнна 73 см, j iaweTp 3 см г с :-уторофоглу5ом -метанолом - .1:1 со скоросгы-э 20 мч/час.,- 5 лавяивают gpaKiiHJi 5 .ш, Откосигеяьное содер жанк-з лизолклйна плюсовых фракций определяют фотоме-грически при 360 нм. Определенкое во фракдялк 40-47 содерт жание лиэолкпнна (I) произвольно счлтают ра.Енкт-5 1 Получает сле.цующее, рпспредделекие Фпакцпя I Отггосительное содеряга- . ние лизол и пи на .1., % Фракция 40--47 из ацетона-эфира .jasoT 416 мг темно-желтых кристаллов л-нолипина (15, т.пл, 260-262°С (с паз южениб -; . Из мaтc :iнык растворов кристаллит зацик и из соседних фракций при повТОРНО.Й ..ро; зтографи,15 на Сефадекс LH - 20 ;лож}зО по.пучить еще 360 мг .ллоэ,