Способ получени -лейцин-13-мотилина Советский патент 1978 года по МПК C07K14/63 A61K38/22 C07K5/06 

1

Изобретение относится к способу получения нового, ранее неизвестного прпипепти- да-Ч«-пейцин 13-мотипина, который может найти применение в медицине.

Известен способ получения L -ворпейцин 13-мотилина ij путем конденсации отдельных пептидных фрагментов модифицированным карбодиимидным методом 2 на основе диаикдогексипкарбодиимид- N-оксисукцинимида и удапением защитных групп трифторуксусной кислотой. Дпя синтеза L -норпейцин 13-метилина были использованы следующие защищенные фрагменты: g

Т. Аргинил(бромгидрат) аспарагИнил-N-трет.г-бутилоксикарбонил-лизил-глицил-гпутамин-тр-ег.-бутиловьг.й эфир (аминокислоты 18-22);

:П. N -Гпутамил-(У-трет,-бутиловый афкр)-глутамил-(У-трет.-бутиловый эфир)ЧЦ -трет,-бутипоксикарбонил-лизил-глутаминовая кислота- Jf-rTpeT-.бутиловый эфир (аминокислоты 14-17)j

11L N (бензилоксикарбонип)-аргииил-норлейцил (аминокислоты l2-13)j

iV. М -Бензилоксикарбонил-глу тамил

(У-трет,.-бутиловый эфир)-лейцип-гпутамп1 (аминокислоты 9-11);

Y. О-третт- Бутил-треонил-О-трет -бутид-ти ози;1-глицин (аминокислоты О-8);

VI. N -трет.-Вутилоксикарбопип-феннпапанил-валил-пропил-изолейцил-4)енипапат1н (аминокислоты 1-5).

Цель изобретения - синтез новых биологически активных производных мотилина.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения Ь -пейцин-13-мотИлина формулы

lisд 6 те 9 10

H-Phe-Vae-Pro-JEe-Pbe-Thf-T n-Qty-G.eu-Leuи 2. -fi 14 15 16 iT 8 19 го -Gen-Ar0--beo-G|eu-C,&u-Lv5-Gtu-Arpf-A«,h-LfS2f 2l.

-G,Ev-G,En-OH

заключающимся в том, что подвергают конде1тсации защищенные фрагменты:

трет.-ёутиловый .эф1тр аргинип(гидробромид)-осп ар агини л-N -трет.-бугилоксикарбо, ниллизил-глицил-глутамина (18-22.);

J -трет.-бутилоБый эфир N -бензилокс карбонил-гпутамил( -трет.-бутилопый. эфир) глутамип( -трет.-бутилоБый эфир)-М -трет.-6утипоксикарбонилпизип-Г71утаминовой кйспоты {14-17); t N -трис.-бензипоксик1Эрбонип-L-aprHHHn-,ii-пейцина (12-13); -бенэипоксикарбонипгпугамип (if -трет.-бутиповый эфир)-пейципугпугамина {9-11); О-трет.-бутиптреонип-О-трег.бутип тирозил-гпицина (6-8) и N -трет.-бутипоксикарбонипфенипапанип-вапип-пропип-изопейцин-фенипапанина (1-5) с помощью N , N -дицикпогексилкарбодиимид- N -оксисук- цинимида, удапяюг зашигные группы трифтор уксусной кислотой. . На фиг. . 1 приведена схем.а получения фрагмента i; на фиг. 2 - то же, фрагменга II; на фиг. 3 - то же, фрагмента фиг. 4 - схема получения (фрагмента III, объе динение фрагментов на фиг. 5 - схе. ма получени$г фрагмента 1Y, объединение фрагментов 0 и (Г-И1).,У1 и V, f-TV и Y-YI. : -, . . , , , ; Ы& схеме и в примерах применены- следу ющие обычные в химии пептидов сокращения и символы: Ь - указатель конфигурации, 2 - бензилрксикарбоннльный остаток, вое - трет.-бутилоксикарбонйпьный ос-та ток, ; ВСС1)г-М,М -дициклогексилкарбодиимидный способ, ., DCCD/HQ;&V .-N, N -дицикпогексипкар. бодиимид- Н-оксисукцищмидный способ. : DCCD/HQBT-N, N дициклогёксилкарбодиимид- N- оксибензотриазольный способ. РАМ - фосфоразогметод, SV - оксисукцинимиднь1й остаток, NP т п-ни трофе лиловы и остаток, tBu. - грет.-бутильный остаток, DBSI дибензосульфимид в качестве со лео.образова,теля, , . . АЛе метипьный остаток, ТРЕ - трифторуксусная кислота. П р:и м ер 1. Получение фрагмента I (часть последОв:ательпости 18-22) Н-ее -Oi B.U (22 Ъ ), получают из Z-GEn ОН (22 d ). этерификацией тре -бутиловьш. эфиром уксусной .КИСЛОТЫ при Пр менении серной.кислоты в качестве катализ торо и посп. удаления бензилоксика . болильной защитной группы гидрогеногшзом. HGEn -OtBu объединяют с Z -QEv -OSV .(21), в результате чего получают эфир бен, зилодсикарб:онил-дипептида(21-22а). N -.Защитные группы снимают гт-гдрогенолизом, полученный П1эодукт H-Qfv -QEn -OtBu (21-22b) конденсируют с Z -Asn-b(s (BQC)-OH (19-2O) N ,N -кapбoдиимид-N-oкcиcyкurшимид)ым способом, в-Резупьта--те чего образуется трет.-бутиловый эфир бе зилрксикарбониптетрапептнда (19-22а). Дипепгид (19-2О) получают посредством аминоацилирования Н-Lvs (ВОС)-ОН (20) с помощью Z -Abn-ONP (19). От соединения Z -A3п. - Lvs (В.ОС)-Qtv -Qtn -Ot Bu (19-22a) бензилрксикарбонильную защит 1ую группу удаляли каталитическим гидрировЁГйием, образующееся при этом сложноэфирное производное тетрапептида (19-22 ) ко1щенсируют с (cP.iw-Zf )-ON Р (18), получают,- 2- Arg(d,.)-A5n - bvs (BOci-QCv -Gen-OiBO ri8-22a).: A. ДибензолсульФимидная соль трет.-бутипового эфира jj -глутамина. 103 г трет.-бутилового эфира бензйлоксикарбонилглутамина в 2 л метилового спирта подвергают к;аталитическому гидрированию : (папладИевая чернь) при прибавлении по каплям 91 г дибензолсульфимида в 500 мд метилового спирта при, рН 3,5. Осадок отфильтровьгнают.Фильтрат упаривают в вакууме,завер шая уп ивание азеотройной отгонкой с бензолом.Раствор маслообразного остатка в этиповом эфире уксусной кислоты смещивают с диэтиловым эфиром.иродукт кристаллизуется. Для более полной очистки продукт перекристал- лизовывают из метилового спирта и диэтилово- го эфира, т. пл. l35-136°G,fctI +10,78(с 1,0; в метиловом спирте). Выход 146г (97% от теоретически рассчитанного зна.чения). Б.; трет.-Бутиловый эфир бензилоксикарбонил-глйцил-Ь -гпутамииа. Суспензию 115 г дибензопсул.ьфимицяой соли трет-.бутилоеого эфира L -глутамина в -800 мл дихиррметана смешивают с 32,2 МП триэтиламина и затем с 70,5 г бензилокси карбонилглицин- N oкcиeyкдинймидoэфиpa. Перемещивайие продолжают .в течение 24 час при комнатной, температуре, затем упаривают в вакууме,.маслообразный остаток раст воряют в этиловом эфире уксусной кислоты, раствор промывают водными растворами пиМОнной кислоты, биХ боната калия и врпой сущат над сернокислым натрием и упарива ют в вакууме. Получают маспоОбраз-ШзГй продукт, выход 87 г (93% от теоретически, рассчитанного значения ) В. Дибензолсупьфимидная соль трет.-буТИПОВОГО эфира глидип-Л-глутамина. Раствор 80 г Трет.-бутйлового бенилоксикарбонилглицил-Ь -глутамина в 9ООмп етиловрго спирта по аналогии со спосрбом, в пункте А, подвергают гидрогеолитйческому дёацилировайию (60 г дибенолсульфимида) и переработке. Получают мае ообразный остаток, который кристаплиззяо при растирании с петролейным эфиром т.пл. (с разл.),(р1., (с - 1,0 в метиловом спирте). Выход 110 г (98% от теоретически рассчитанного значения). Г. Бензилоксикарбонип-lj -аспарагинил-N -трет.-бутилоксикарбонил-Ij-лизин Раствор бензИлтриэтиламмонийной сопи, полученной из 51 г N -трет.-бутипоксикар бонип-1л-лизина в 7ОО мл диметилформамида перемешивают в течение 48 час при 20 С с 81 г 4-нитрофенипового эфира бензилоксикарбонип-L-аспарагина и 1 .эквивалентом пиридина. Реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток обрабатывают этиловым эфиром уксусной кислоты и раствором кислого сернокислого калия. Образовавшийся рыхлый осадок отфильтровывают и затем перекристаллизовывают из смеси этилового спирта и лтетролейного эфира, т. пл. продукта 174-175°С (с разл.),.э° +. (с 1,0, в пиридине). Выход 70 г (71% от теоретически рассчитанного значения). ; Д. трет.-Бутиловый эфир бензилоксикар- бонйл- 1«-аспарагинил- -трет.-бутилоксикарбонил-1 -лизипглицип- U -глутамйна. Растпвор 61,5г дибензбпсупьфимидной сопи трет,-бутилового эфира глицил-U -глутамйна и 54,5 г бензилоксикарбонил-Ц-аспара гинил-N .-трет.-бутилоксикарбонил-Ц г-лизина в 7ОС л диметйлформамида смешивают при О С .вначале с 15,5 мл тpиэтипaминa и затем спустя 15 мин с 13 .г N -окснсук- цйнмида, а также 23 г N , N-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную массу переме шивают при ОС в течение 3 час, .затем тем пературу поднимают до комнатной в течение последующих 24 час,перемешивание продолжают при Комнатной температуре, Н , N -дицикпог.ексилмочев ину отфильтровывают, фильт рат упаривают в вакууме. Пояученнь1й остаток кристаллизуют из этилового эфира уксус ной кислоты. Продукт чистят перекристаллизацией из смеси метилового спирта, воды и изопропилового спирта и этилового эфира уксусной кислоты, т. пл. продукта 155-156 С LC.J-JJS- -2О,8 (с - 1,0, в этиловом спирте). Выход 63 г (78% от теоретически рас считанного значения), Е. Гдарохлорид трет,-бутипового эфира 1д -аспарагикил-N -трет.-бутилоксикарбонил-Ь-пизипгпицип-1,-глутамйна.. 47,S г орет.-бутипового эфира бензилоксикарбонил- L -аспарагинцл- N -трет.-бутилокси карбонил- U -лизилглицил- Ь -глутамйна Сполу чен в соответствий с пунктом Д) в 8ОО мл метилового спирта гидрируют в описанных выше условиях. Значение рИ поддерживают постоянным (5,5) с помощью 25,2 мл 2,5 н раствора хлористого водорода в метиловом спирте. Осадок отфильтровывают, фильтрат. упфдаают,образующийся при этом мпспообрачнь1й продукт при раст1фа11ии с днэтиповым эфиром кристаллизуется,давая бесигзепгое liopeiniкообразное вещество,т, пл. ЭЗ, ( ° ,5 (с - 1,О,;в метиловом спирте). В)лход 4Oi(97% от теоретически рассчитанного дипча™ °л & Ж. трет.-Бутиповый эфир N , N , М -грнс-бензилоксик.арбонип- Ь -аргинип- -асггарагнsffln-N -трет.-бутипоксикарбонип- Ь -пизипгпиИИП- Ц -глутамйна, 31,9 г гидрохлорида трет.-бутипового эфира U -аспарагинил-N -трет.-бутилокси|сарбошш- Ц -лизилглицил- Ь -гпутамина (подученного, в соответствии с пунктом Е) и 33,68 г N -оксисукцинимпдного эфира N , N N Грис- бензилоксикарбонил- Ь -аргизмна в 1 л диметйлформамида смешивают при с 7 мл триэтиламина. После 24 чос перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток переосаждают из метилового спирта и воды и затем перекристаппизовывают из метилового спирта, получают бесцветный пороиькообразный продукт, dl-j) которого -7,6 Сс 1,0, в ледяной уксусной .кислоте). Выход 46,5 г (8О% от теоретически рассчитанного значения), -3. Гидробромид дигидрат трет.-бутипового эфира Ь -аргин1дл-(гидробромид)-Ь-аспарагинил-N -трет.-бутилоксикарбонип 1( -лизилглидил- Ь-глутамйна.. 45,5 г трет.-бутилового эфира N jK N -трис-бензипокспкарбонил-Ь-ар.гинил-Ь -аспарагинил-N -трет.-бутилоксикарбонип-.Ь-лизилглицил-U-глутамйна (получен в соответствии с пунктом Ж) -в 1,5 л.смеси диметйлформамида и метилового спирта (2:1) подвергают гидрогенолитическому деацнпиро ванию при поддерживании постоя того значения рН (4,5) с помощью 8О мл 1 н pacDвора бромистоводОродной кислоты. Осадок отфильтровывают, фильтр.ат упаривают в вакууме, остаток переосаждают из смеси этилового спирта и диэтилового эфира, получают аморфное порошкообразное вещество с -4,8 (с 3,0, в 8О%-ной уксусной кислоте). Выход продукта 37 г (98% от теоретически рассчитанного значения). Выход по всем стадиям ЗВ% в расчете на исходный H-QEn - OtBu (22b). 2о - -7,6t соответственно cAlj jj . -9,4 (с - 1, в уксусной кислоте). ЧистЬт-п продукта проверена хроматографически в системах: н-бутаноп-педяткш. уксусная кислота-Ьода 3;1:1 и Ti-r.enTaif-тр.е- тичный бутиловый спирт-педя1 ая уксусь-ая кислота 5:1:1. Рассчитано/1шйдено,%: С 57/98/57,70j Н 6,69/6,504 N 13,29/13,29; О 22,02/ V22;45. Бенэипоксикарбонипьные защитные груп.пы удаляют посредством каталитического гидрогенолиза при добавлении двух эквивапентов бромистого водорода. Получают фрагмент I , а именно H-Afg {HBr)-Aftn -LvS(Bocj-qe -qen-ot ви нв. ii8-22b). Выход 98%, -4,, соответственно tdl5 -6,О 5 (с « 1, в 8О%-ной уксусной кислоте). Чистота проверена хроматографически в системах: н-бутиловый спирт ледяная уксусная кислота-вода 3:1:1 и третичный амиловый/спирт пиримидин-вода 35: :35:ЗО.: Рассчитано/найдено, %: С 4O,21/4O,46i Н 6,85/6,93} N 16,12/15,89; ВР: 16,72 /16,51. П р и м е р 2. Получение агмента И (частичная последовательность 14-17). Эфир бензилоксикарбонилдинептида С1617а) получают конденсацией -7- - bsie (ВОС) -OSV (16) и (Ot Ви )-ОМе (17). Последующее щелочное омыление эфира и следующее за ним каталитическое диацилирог вание через дипептидное производное (1617 t ) приводит к полученщо Н- Lvs (ВОС)-Qbu (Ot Bu )-ОН (16-17с).Продуктконденсируют, дважды последовательно с Ь -QBs-(O-b Ви )-OSV (15,соответственно 14), причем каждый раз в качестве главно- го компонента применяют производное глутаминовой кислоты. Таким способом получают .ент I , а именно Z -Q6u-(OtBu| -qcu (Ot Ви )-uje (Boc)-Qeu(ot )-ОН (14-17a). Назван№1е продукты получают способом, описанным в примере 1. Выход 48% в расчете на исходный H-QBo (Ot BU. )-ОМе (17); т. пл. продукта 147149°С. - -9,8.1 1°, соответственно А . -12,3° (с 1, в димгетилформамиде).;чистоту проверяют хроматографически в систем циклогексан-хлороформ-ледяная уксусная кис лота 45:45:10. Рассчитано/найдено, %: С 59,02/58,70; Н 7,86/8,04; N7,48/7,72. П р и м ер 3. Получение фрагмента Ш (частичная последовательность 12-13). Для получения N N , N трис-бензилоксикарбо1жл- U-аргинил-Ь-лейцина 30 г Z .-Argr (сУ,Ш Z::)-OSV (12) и 11,6 г лейцина (13) вводят во.взаимодействие при перемешивании в течение. 18 час в смеси диоксана и воды (1000:500 мл)после добавле1тя 89 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия. Подкислив 89 мл 1 н. соляной кислотЬ, реакционную смесь обрабатывают этиловым эфиром уксусной кислоты, раствор промывают разбавленной соляной кислотой и водой, сушат над сернокислым натрием, растворитель отготиют в вакууме. Остаток переосал дают из смеси вода-метанол и этй ловый эфир уксусной кислоты-диэтиловый эфир-петролейный эфир. Выход 26,6 г (86,6% от теоретически рассчитанного значения); т. пл. 126-128°С; d, г -5,8 + 1 , соответственно 54 -7,1 (с - 1, и уксусной кислоте). Чистоту продукта проверяют с помощью хроматографии в системе: н-гептан-третичный бутиловый спирт-уксусная кислота (5: :1:1). Рассчитано/найдено, %: С 62,6/62.59: н 6,28/6,41; N 10,15/9,94. Аминокислотный анализ: АРСГ 1,ОО; Ьеу 1,00. Пример 4. Получение фрагмента.j (частичная последовательность 9-11). Дипептид -ОН, вводят во взаимодействие с 2 -Geu(Ot Ви )-OsV (9). . врезультате получают с выходом 74% фрагмент W , а именно Z -Geu(ot Вц )-ьеи-qen -он (9-11). Условия проведения эксперимента, как в примере. 1, т. пл. продукта 146- 148°е, EAli)- 31,6.±1 , соответственноЕ Д54б 5 -.38,1 (с « 1, в метиловом спирте). Чистоту продукта проверяют хроматографически в системах: н-гептан-третичный бутиловый спирт-ледяная уксусная кислота (5:1:1) и -бутиловый спирт-ледяная уксусная кислота-вода (3:1:1). Рассчитано/найдено, %: С 58,12/58,05; Н ,24; N 9,68/9,48. П р и м. е р 5. Получение фрагмента N (частичная последовательность 6-8). Соединение (tBu )-QCa-OH (7г. -8) конденсируют с Z -TtiK( tBu )-OSV (6), получают бензилоксикарбошлтрипептид (6-8а), который в результате каталитическо.го гидрогенолиза давал желаемый фрагмент; 1, а именно H-TtiK tBU )-Туг (iBu ) (6-81)). Эксперимент проводят в условиях, описанных в примере 1.; Выход продукта 81% по двум стадиям .в расчете на примененный дипептид (7-8)j т.пл. 126-127°С, t э(,+7,9 .± 1°, соответственно dtj л/ +8,9 (с 1, в метих ловом спирте). ХрОматографический контроль чистоты про дукта осуществляют в смеси третичного амипоБОГо спирта, пиридина и воды, взятых а соотношении 35:35:30, , Рассчитано/найдено ,%: С 60,88/60,69; Н 8,30/8,31; N 8,88/8,91, в расчете на д1шептид 1/4 моля. кристаллизационного этиловотх) эфира уксусной кислоты. П р им е р 6. Получение фрагмента Ч (частичная поспедовательность 1-5), Карбодиимидным способом Z -ЗВе-ОН (4) объединяют с H-Phe-OtBu (5). В резупьтаге последующегх каталитического гидрогенопиэа промежуточного эфира бенэипоксикарбонилдипептида (4-5а) выделяют Н Ifilje-Ptie-Oi Ви (4-5lj) с выходом ййще 9О%. Одновременно фосфор азо- ;пособом конденаируют ВОС-VaE -ОН (2а) и Н-Рго-ОМй (За), в результате чего получают эфир трет, бутилоксикарбонилдипептида (2-За). Последующее щелочное омыление сложного эфира приводит к получению с вьгходом более 70% BOC-Vo(e;-Pj 0-,OH 12-3 Ь). Более просто и с более высоким выходом (83%) дипептнд (2-313) получают конденсацией B00-Vol&-05 V (2Ъ) с двумя эквивалентамипролина (ЗЪ). Оба дипептидных производнь1х объединяют с помощью карбодиимидного способа с образованием Boc-vae -Pro -3ee- he-otBu (2-5а. Воздействие. тртя}).торуксусн6й кислоты на (2-5а). приводит к получению свободного тетрапептида Hr-VoiE-Pi o- Be Phe-ОН)2-5D),K которому обычным и известным способом присоединяют BOC-PTie -OSV - (1) с образованием ВОС- - оВ-гРТо-Зсе-PJie-O (1-5а) (фрагмент 41 ).. Условия эксперимента описаны в примере 1. Выход продукта 63% по трем последним стадиям в расчете на (), т. пл. 218%;, сЦ XI - 64,2 i l, соответственно{ сА, ..г -75,82 (с 1,. в уксусной кислоте), Хроматографическая чистота продукта про верена в смеси н-бутипового спирта, ледяНИИ уксусной кислоты и воды, взятых в соот ношении 3:1:1, и в смеси третичного амилового спирта, пиридина и воды, взятых, в соотношении 35:35:30. Рассчитано/найдёно,%:С 64,88/64,72; Н 7,64/7,701 N 9,70/9,61. П р мер 7. Конденсация фрагментов I - X (полная поспедовательность 1-22) Фр1агмент I (18-22Ъ), содержащий крниевую карбоксильную группу, объединяют с фрагментом I (14-17а) карбодиимидным способом и полученный трет.-бутиловый эфир N-бензилоксикарбонилнонапептида (14-22U,) посредством каталитического гидрогенолиза переводят в H- KuCOt Bu )-Gieu {ot BU ). (BOC)-Geu (0-t Bu )- (HB )-ASn - Lvs(BOC)-,G&)-G|ett-0t Вu (14-221). ; Соединение с фрагментом Ш с помощью указанного способа приводит к образованию I Arfl--((f -ш- Z2)-Ьеи-0,еи (01 Bu )-GP.U (Ot Во )-Ьчв (BOC)-eiEu (Ot Bu ) (HBf )-Asn-bs(s(BOC)-G,Ev-GEnГ 0t В и (12-22a). Каталитическим гидрировашем из ундекапептида (12-22а) удаляют гри бейзилоксикарбонильные защитные группы и в результате иейтрапизации появившихся свободных гуанидиновых функциональных групп бромнстоводородной кислотой в процессе гидрирования получают (HBl )leu-G&u .(ot Ви )-Gibu(0t Ви )-Lss(BOC)-G,eu(ot Bij )-Arg-(HBr )-Asn-bvs.(BOC)-G,ev-G,en-Ot Bu (1.2-22 Ъ) в форме гидробромида. Ущекапептид концентрируют с фрагментом IN (9-11) указанным дицикпогексилкарбодиимид-М -оксибензогриазопьным способом и из полученного тетрадекапептидного про- изводногр (9-22 d) посредствомгицрогенолитического отщепления бензилоксикарбонипьных защитных групп получают Н-Ь&и -(OtBu }-Leu -.GiEu-Argr-(HBl- )-Leu-Geu (Qt Bu )-CiEu (Ot Bu )-L4S-(BOC) (ot Bu )-Arg-(HB )-Asn-Lvs (BOC)-G,e(-Gren-OtBu ().. В процессе указанной реакшш объединяпись фрагменты t (6-801) и N1 (1-5а), последний.после переведения его в N -окси-сукцинимиднь1й (1-5 Ъ), Однако чистый BOC-Plie-VoiE-Pro-aee-Phe-Tht- -ави ) -Ъг (tBu) (1-8), получить не удапось, аминокислотный анализ показал наличие примесей . в количестве пример1ю 1О% (1-5а) или (1-513). Попытки разделения этой смеси остались безуспешными. Полученный неочищенный участок (1-8) объединяют дициклогексипкарбрдиимид- N оксисукцинимидным способом с указантым выше участком ( 9-22Ъ), в результате FTOлучают БОС-Phe -VaE-Pro-UEe -Phe-Tht--(iBu)-Tyr(-t-Bu) -Q y-QEu(OiBu)-Leu-QPu- -Ang(HBr)-Leu-agu(OlBu)-Q2u(OiBu)-Lye, ; (BOC)-qEu-((HBh)-AbH-L,yu(BOC)rQ y-QEu-OlBU (i-22a). После отщепления всех защитных групп с помощью безводной трифторуксусной кислоты и последующей замены трифторацетатных ионов брома посредством ионообменной хроматографии на слабоосновной, ионообменной смоле Дауэкс 44 (ацетатная форма) получают неочищенный лейцин-13-мотилин (l-22b), который вследствие на.личия неочищенного участка (1-8) имел ошибочную последовательность, что также подтвердилось при операции очистки. Конденсацию фрагментов проводили в следующих условиях, -. . А. Конденсация I со | 9,2 г 4рйгмента 1 (в соответствии е примером 1 3), 9,36 г фрагмента Ц (получен в соответствии с 1фимером 2) и 1,4 мп триэтиламина в 200 мл диметилформамида смешивают при О С с 2,3 г К -океисукцини1йида и непосредственно после этого с 3,1 г N , N -дйцикпогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение 24 час при 5 С и затем в течение 4 дней при комнатной температуре, псхЬпе чего осадок отфильтровывают, а фильтрат упарившот в вакууме. Полученный остаток несколько ра обрабатывают водой и наконец два раза пёреосаждают из метилового и этилов(йЧ) эфира уксусной кислоты. Получают в форме аморфного порошкообразного вещества трет.-бутиловый эфир бензилоксйк бонип- -глутамипС З-трет.-бутиловый эфир)-i -глутамил(2 -«рет.бутил1 вый эфир-М - рет. бутилокйикарбонил-L глйзил- Ц -4 лутамил{ jf -трет.-бутиловый эфир)- Ц вргинил(гидробромид}- L -вспарагинил- Н трет.-бутилоксикарбонил- L -чпизилглицилглутамина. Ц чэ -14, (с 1, в диметилформамиде). Выход 14,8 г 184%оттеоретически рассчитанного значения). Раствор 12,3 г полученного соед)а нения в 8ОО мл метилового спирта при ноддержа НИИ постоянного значения рН подвергают ка талитическому гидрированию обычным образом (рН 5,5, 7 мл 1н. бромиетоводородной кислоты). Фипьтрат.упаривают Б вакууме и полученный остаток дважды переосаждают из этилового спирта и этилового эфира уксусной К,ЬСПОТЫ.1 В результате в виде желаемого продукта конденсации (14-22b ) получают гидробромид. грет.-бутиловогб эфира Ь -глута1у1ип( :-трет.-бутиловый эфир)-Ь-глутамилСТ-трет -бутиловый эфир)-,-трет.-бутилоксикарбовип- -пизил-Ь -глутамипСУ-трет.-бутилочвый эфир)-Ь-аргинип(гидробромид)- Ь-аспа рагинил N -трет.-бутипоксикарбонип- j -пизипгпицилглутамйна,, . 21,5 (с . в метиловомспирте.). . Выход 11,4 г (96% от теоретически рассчитанного значения).i . Б. Конденсация (I - 5 ) с Ш , Раствор 1,7 г пептида (14-22 Ъ ), Is4 г 2-Ar-g-(б,ш-22)-Ьеи-ОН (12-13), 0,3 г Ы-оксиСукцинимида и 0,14 мл-триэтипамина в 1ОО мл диметипформамида смешивают при -1О°С с 0,412 г N , N-дйцикпогексилкарбодиимида и реакционную смесь перемешивают 24 час при 4 С, затем еще 24 час пр комнатной температуре. Выделивьауюся в осадрк дицикпогёксилмочевину отфильтровывают, фильтрат утгарггеают в вакууме иподученный после упаривания остаток переосаждешэт из метилового спирта и этилового эфира уксус 59 ной кислоты. Полученный продукт тщательно обрабатывают водой, фильтруют и сушат, В результате получают трет.-бутиловый эфир N , N° ,Н -трис-(бензилоксикарбоНИЛ- Ц -аргинил-U -лейцил 1| -гяутамил-1Т -трет.бутнловый 9фир)-Ь -глутамилГ Г-рет -бутиловый эфир)- М -трет.бутилоксикарбо нип-Li -лизщ-Ц -глутамил(с}-трет.-бутиловый эфир)-Ь -аргинил(гидробромид)-U.-acп агинил-М -гтрет.-бу тилоксикарбонил-. Ц- пизилглицил- L -глутамина {12-22а). Выход 1,94 г (85% от теоретически рассчитанного значения). Хроматографическую чистоту продукта проверяют путем хроматографирования в смеси н-гептана, третичного бутилового спирта и уксусной кислоты, взятых в соот нош©нии 3:2:1, и в смеси н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды, взятых в соотношенйзн 3:1:1. Данные аминокислотного анализа: , 2,02, Агог2,01, Asp. 1,00, eii 3,98, qe:a 1,01, Ueu. 1,00. 1,8 г пептида в 50О мл метилового рпирт а подвергают деацилированию посредством каталитического гидрирования при добавлении по каплям 15j7O мл 0,1 н. бромистоводородной кислоты, при значении рН 4,5. Катализатор отфильтровывают. Фильтрат упаривают в вакууме, полученный остаток переосаждают из метилового спирта и этилового эф№ра уксусной кислоты. Ш учают.дигидрат гидробромида трет,- . -бутилового эфира 1| -аргинип(гидробромид)/ - Ь -лейцил-Iri -глутамип-(2р -трет.-бутиповый эфир):1 -гпутамил(-трет,-бутиловый эфир)-,й -трет.-бутилоксикарбонил-и .лизнл -1 -J -гпутамип(З-трет.-тбутиповый эфйр) -арги, нипСгидробромид) -аспарагинйп-Ы -трет,-бутйло шсарбрнил-с1 -лизиЛгпиаип-,1 -гпутамина (12-22Ъ ),, Выход 1,61 г (98% от теоретически рао считанного значения),:: Рассчитано/найдено,%: С 47,12/47,20; Я 7,43/7,50; ,N 14,07/14,00 В, Конденсация (I-D-ffl) с G-. 1,5 г пептида (12-22 Ъ). и 0,87 г пептида (9-il) в 1ОО мл диметилформамйда конденсируют в условиях, описанных в пункте Б способом, при добавлении О,1О5 мл триэтиламкна с 0,210 г li -оксибевзотриазола и 0,320 г дициклогексилкарбодиимида.. . :, ....-.. Получают дигидрат трет.-бутйлового эфира N -бензйлоксй-карбонип-l -глyтaмиn(-трет.-бутипрвый эфйр)г U -пейцил- U-глутаминйл-.Ь-фгинйл( гидробромид)- 1.-лейци№- .гамйп(у-трет.бутиловый эфир)-М. -трвт.бутилоксикед)бонил- L -лизил-,Ь -глута/ ч I / мйпу -трет.-оутиловый эфир)- -аргинйл(гндг робромид)- ц -ж парагинип- N -трет.-бутйпоксикарбонип- Ь -пизипгпицип-1 -гпугамина (9-22а). Выход 1,Ь г (83% от теоретически рассчитанйого значения). Рассчитано/найдено, %: С 51,41/51,28; Н 7,57/7,55; N 13,63/13,57; Bf 6,22/ /6,15, 1,6 г пептида (9-22а) в 6ОО мп метило вого спирта деаципируют посредством катапитического гндрир6ваняя,подде{)живая посто янньш значение рН,по аналогии с описанным в пункте Б, Катализатор отфильтровывают, фипьтрат упаривают в вакууме и полученный остаток пере осаждают, из метилового спирта и этилового эфира уксусной кислоты, Получают тетрагидрат гидробромида трет, -бутипового эфира U -глутамип( .-бутиловый эфир)-Ь-пейнил-It-rnyTaMmnw-; -аргини л {гидробром ид)- U-пейцил Ь -глутамил( Т-трет.-бутиловый эфир)-Ь -глутамил (,/У-трет.-бутиловый эфир)- -трет.-бутилоксикарбонилгЬ -лизил-тЬ-глутамил{ -трет. -бутилоЁый эфир)-Ь-аргинилСгидробромид)-.L-аспарагинил-М -трет.-бутилоксикарбонил-.1 лизилглицил-14-глутамина {9-22Ъ). &.1ХОД 1,5 г (96% от теоретически рассчитанного, значения), -5, и 3 -7,2 (с О,7, в метиловом спирте Хроматографическая однородность продукта показана в смеси н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды (3:1:1)., аминокислотного анализа: .liVS . 2,04, A)rg-2,01j ASja 0,98, GKu 6,05, Stv l,lo,,Ueu 2,00. Г. Конденсация S J Д 2.1,6 г фрагмента .41 и 6,9 г Н -оксисукцинимида в 4ОО мл диметилформамида смешивают при температуре,-5 С с 6,3 г /W,N -дициклогексилкарбодиимида. Реакциойную смесь перемешивают 2 час при ОС и затем в течение ночи при комнатной температуре. После фильтрования фильтрат упаривают в вакууме. Полученный маслообразный продукт кристаллизуют иа и1зогфопилового спирта, .. Получают N -оксисукцинимидный эфир трет.бутилоксикарбонир- U Ф нипаланил-Ь -вапи№-.Ь -пролил- -изолейцип- W-Фенилапанин. Выход 21.3 г (88% от теоретически , рассчитанного значения), т. пл.. 190-192 С + 59,28° (с 1,О, в диоксане). 12,2 г фрагмента Л/ и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметилформамида смешивают с 14,8 г;указанного выше сукцинимид ного остатка, полученного из фрагмента VJ После пёремеш1 вания в reHeiffle 24 час при комнатной температуре реакционную смесь упаривают в вакууме и полученный меюлообразный остаток распределяют между этиловым эфиром уксусной., кислоты Г раствором лимонной кислоты, i acTBOp продукта в этиловом эф1фе уксус1юй кнспоты промываьог/ сушат и упаривают в вакууме . Из смеси этилового эфира уксусной киспотьт к петропейного эфира получают в виде бесцве1 ного кристаллического вещества трет.-бутилой сикарбонил Ь-фенипаланил-1 -вапип-Ь -пролил-Ь -изолейцип-Li -фенилаУганил-О-трет,-бутил-L -треонил-О-трет.-бутил- -тирозкйглицин (1-8), Выход 18i2 г (87% от теоретически рас-. считанного значения), dl 1 - -44,0° (с аг в этиловом спирте), /Д, Конденсация (1 -И -IM-W) с (V - Nj), 1,28 г пептида (9-22 Ь), попучеиного в cooTBercTBtffl с пунктом В, 1,17 г йептп-, да (1-8), получеююго в соответствии с пунктом Г, О,О7 мл триэтиламина иО,и.5г Н-оксисукцинимида (или в .другом опыте 0,2О г Н -оксибензотриазопа) и 1ОО .мл димегияформймида смешивают при темперптуре -1О с 0,206 г Н , f -ди шклогекс 1п карбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 дней при О С и в течение З.дней при комнатной температуре. Полученный после удаления растворителя в вакууме остаток тщательно обрабатывают нагретым этиловым афиром уксусной кислоты,, смолообразный продукт первоеаж.даюг из метиловргю спирта и этилового уксусной кислоты и после растирания с этиловым эфиром уксусной кислоты сушат. Затем в течение 5 час продукт тщательно обрабатывают водой и переосаждают из метилового cniipra и воды. Получают гексагидрат треп-бутилового ,спнр,.а W -трет.-бутилокснкарбонил- Ь --(|)енип апанил- М-валип- 1«-пролил- -Ь -изолейщш- -фениЛаланил-О трет,-бутил- Ц-греонил- О -трет.- бутил- и-тирозш1глицил- Li -глутамга (-трет.-бутиповый эфир)- -лейцнп-Ь -гпутаминил-L-аргинйл(гидробромид)-Ь- гшйцил,1«-гяутамил(З-трег.бутиловыЙ эф1ф)- - гпутамил(|-трет.- бутиловый эфир)-N -. -трет.-бутилоксикарбонил-(.4|-лизил- U г/ утамил (.-трет.-бутиловы и эфир)- Ь -аргин11л(гид:робромид)-.1: -аспарагинил-Н- -трет.-бугилоксикарбоннл- Ь-лизилглииил- ij .-глутамина (1-22а), Выход 1,65 г (91% от теоретически рассчитанного значения), Рассчита.но/найдено, %: С 54,03/54,13; Н 7,82/7,80; - 12,68/12,67; Bf 4,38/ /4,6.; 1 г защишенного пептида ()s полу чешюго в соответствии с пунктом Д, смешивают с 40 мл охлажденной льдом трйфторуксусной кислоты и смесь выдерживают в течение 2 час при комнатной температуре. Избыточное количество трифторуксусной кислоты уваляют в вакууме при возможно более низкой температуре, полученный остаток рас воряют в разбавпешюй уксусной -киспоте, раствор два раза обрабатьтвают 4 г слабо основного анионообменника в ацетатной форме (например, Дауэкс 44), после чего элюат, полученный после проведения ионного обмена подвергают лиофилизации. Получают 1 -фенилаланилг-14--валил-г, -пролил- L - изолейцип- U -фенилаланил-: L -тре онил-иг-тирозилглицил- с1 -глутамил-L -лейцип- 1 -глутаминил- Ь - гинип- Ь -лейцил Ь -глутамил- U -глутамил- .и -лизил-1| -глутами - Ц-оргинил-L -аспарагинип-лизилглицил- U глутамин. Выход продукта 0,7 4 г. П р и м е р 8. Получение чистого продукта и аминокислотный анализ. Очистку проводят с помощью ионообменной хроматографии при использовании сильно основной анионообменной смолы, напри- мер, находящейся в ацетатной форме и известной ПОДнаименованием ОАЕ-сефа.декс А-25 смолы на основе модифицированного декстрана с диэтйл-(2-ОКСипропип)-аминоэтильнЬ1ми остатками в качестве функционал ных rpyntt, и затем при применении сильно кислой катионообменной смолы например, н ходящейся в аммонийной форме и известной под наименованием ЗР-сефадекс 0-25 см 1лы на основе модифицированного декстрана с сульфопропильнь1ми остатками в качестве функциональных групп. Аминокислот№1й анализ проводят после кислого гидролиза (6 н. соляная кислотй) пептида, причем оказалось, что практически одинаковые значения достигаются при проведении гидролиза в течение 2О и 72 час. По лученные результаты представлены ниже. Рассчитано Найдено Из 2,00 2 2 1 1 6 1 2 ArgAspThr .1 59 9 1,942 0,931 1,822 Бриопогическая активность свежевысушенного ti -лейцин- 13-мотилина практически равна активности ;li -норлейцин-13 мотилина, таким образом, почти не отличается от активности природного мотилина. Формула и 30 б р е т е н и я Ь -лейцин-13-мртилиСпособ получения на формулы 1 34 567 в5 H-Ptie-yae-Pfo- ee-Phe-T-hr-T r-CiE -Qeil10 И 12 1Z 4 Y5 16 П 16 -beu-(en-Argr-Leu-Qeu-QEu4v5-Gieo-Artr 920 гГ Z2 -Aen-b(s-C,e: -QCn-OH о т л и ч а ю щ и и с я тем;; что подвергают конденсации в любой поспеабвательности защищенные 4 агменты: трет.-бутиловы эфир аргинил{гидробромид)-аепарагинил-|(-ipeT.-бутилоксикарбониллизил-глйцил-гпутамина (18-22),,У -трет.-бутиловый эфир N -бензилоксикарбонил-глутамил (Jjj-TpieT.-бутиловый эфир)-глутамил(.-бутиловый эфир)-М -трет.-бутилоксикарбониллизил глутаминовой кислоты (14-17), , К , N -трир-бензилоксикарбонил-1 -аргинил-Ь-лейцина (12-13), N -бензилоксикарбонилглутамилСТ трет,-бутилоэый эфир)-лейцилглутамина (9-11), О-трет.-бутиптрёонил-Or-TpeTiбутйлтирозил-глицина (6-8) иК -трет.-бутилоксикарбонипфенйлапанил-валилг-пролил-изолейцил-фенилаланина (1-5) с помощью , Ы-дициклогексилкарбодиимид-{ 1 -оксисукцинимида и удалением защитных групп трифторуксусной кислотой. Источники ифнормации, принятые во внимание при экспертизе: 1.Авторское свидетельство по заявке № 2О139Й,8/23-О4, кл. С О7 С 1ОЗ/52, 1974, 2,Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. I , М., Мир, 1967, с. 116.

Z-dl:y-O V/2l7 и-б-tn-OtSii 2}B$J 22Ъ

z-A n-fjNpfig H:-Ly -oH/j o/ zsoe

гZ-Affn - L - OH 19-20J Z-A n722 - Jl/rf - ONP le Н-А9П 7.2yO(i

II Irт

Afg - A0«- Y - c-zy - -otBt/ IB -zzffj

JJBfSOC

Afg - -iy - d-/y - cJ-fr - ie-Z2b

ff - СГу- d-ln -OtSz/ DB $1 21 -22 Ъ

irz/Pd)JWr

Фиг.1 n Jr- m-oiBv 21-220 2}ff(a/ijv0v sod . L - (гy in -oi-Bn l9 -Z2a ,2/P yoC I iTf - 6-7y-d 1Я - Of Bw -22 &7

OiSv z- tu-o r/jfj/ OiBv I OiBu OtBti I Z- tu-0$V i Jf-t rluOfBu OiBu BOff OtBu

IIII,

2 - (/t/- 6-rw - Ly - Я«-ОН /74 -J7ofy

BOf

OiBu JJ- lu-OMe 17

Bod

QfVu

I

I

(lu-OMe l6-17(j

Фи&.г NaOH БОС otBv .. Z - €-lu-OH 6j nijPd BOtf OtBu Л-1У0 - f iu-oH le-ne t BptI OiBii II.7 - (iu- OH is-120 Ш/Pd BOC QiBu I l.(irlt/-OHflS-J79}

«5

- I