Способ получения ферментного препарата каталазы Советский патент 1978 года по МПК C12D13/10 

Изобретение отнсюится к технология по/гучения ферментных препаратов, в частности катализы из микробиологического сырья, и может быть использовано в ферментной промышленности.

Известны способы получения каталазы из AOfior-oro и дефнцитног-о сырья животного происхождения, например печени и эритроцитов крови l .

Ощшко каталаза, полученная из тканей животных, обпадает узким oinniNiysfOM рН действия, недостаточной те 1моустойчивостыо и невысокой устойчивостью к действию перекиси водорода и ряда де} атурирующих cfitiKторов, чтоограничиваетее промышле)1ное испол и3оиан11е.

Известен способ выделения катапазы из микробиологического сырья, в и;(;сукх;ти из кулыуралыюй жидкости AspeigitEus ntger, путем сорбции формелта на ||юсфорипирован„yv; поппоиозу при рН 4,0-5,5 с посяедуК)lucit песорбиией фоа1)гпным буфером с рМ 8,0 2.

Э-101 способ ледостаточло эффективен и не .ч;иио;1 промыш.чезнного примеп.ния.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности является способ выдележш очищенных ферментных препаратов каталазы из культуральной жидкости гриба PeniCiCfiuTn Vttafe PidopE. et , получаемой при глубинном выра;11чвании гриба по авт. ев ид. № 35 3956 L3j

Способ включает адсорбцию .каталазы на гепь-4юс-фате капьция, отделение адсорбента с катапазой, выделение каталазы эщоцией, осаждение фермента спиртом и очистку препарата диализом. Выход катапазы в npenafiaro составляет 7О-8О% от ее содер- жш(ия в культуральной жидкости.

Каталаза, полученная по этому способу,

обладает широким опти)умом рН действия, высокой термоустойчивостью, достаточной устойчивостью к действию перекиси водорода и ряда денатурирующих факторов, а также имеет высокую ;vдельцуючштивиость: ( Kat 460000 ).

Но при поггучении фермента по описанному способу %пию;1Ий гриба является отходом производсгва, о то .-«.« «veNfH уста.мовле)10, НТО в п юизводстве)шых условиям npir гпубин-,. .ifOM выраиншакл; Pentcitfium VitaEs , обес печивающем максимальное накоппелне катапазы. в ку.пьтуральной жидкосги, в мицелии остается 30-1 ОО% фер) }1О отноше шо к его содержаичю в кульгуральнон жидкости Целью нзо6ретен1ш явпяется расшнрелне сырьевой базы за счет использования в качестве сырья минешш гриба-PeiiiciEEiiiin .Vltofe являющегося отходом производства. Эта цель достигается тем, что в способ получения очищенного ферментного препарата каталазы из гриба PefliciECiutt VitciC€, пpeдycмaтpивaющe f адсорбцию катапазы на гель-фосфате кальция, отделение геля с адсорбированной каталазой, элюированне каталазы одноосновным фосфорнокислым калием, осаждение ферме1 та спиртом с последующим диализом к сушкой, в качестве исходного сырья используют мицелий гриба Penidteium VitoiCe , при этом последний измельчают- и из него экстрагируют фермент водой, а адсорбцию каталазы на гель-фосфата кальция осуществляют : из экстракта при рН 6,8-7,2, причем перед элюированием гель с адсорбированной каталазой промывают водой с последующим отделением его от воды. Способ попучет я очищенного ферме}1тно- го препарата каталазы осуществляется следующим образом. Мицелий гриба PenitiEttti-m V tciEe PidopE. et BiCoi отделяют от культуральной жидкости, измельчают и экстрагируютфермент водой, рН экстракта равн-э 6,9-7,2. Экстракт отделяю и прибавляют к нему при перемешивании рав

объемы 0,5М растворов хлористого кальция и двухосновного фосфорнокислого натрия в количестве, рассчитанном из содержания каталазы в растворе и сорбционной емкости образуемого геля.

Гель, образовавший 1 мл 0,5 М раствора хлористого кадьцил и 1М 0,5М раствора двухосновного фосфорнокислого натрия, адсорбирует из раствора 8ООО-9ООО единиц каталазы. Это соответствует сорбции на гель, образованный из 1 г хлористого кальция и эквимолярного количества фосфорнокислого натрия, 80000 единиц каталазы.

Гель.с адсорбированной каталазой отделяют от раствора, промывают водой и центрифугируют.

Элкжруют каталазу при интенсивном пе ремещивании в течение 4,0-45 мин 1 М

измельчают и из него -экстрагируют фермент водой, а адсорбцию каталазы на гель-фосфате кальция осуществляют из экстракта при рН 6,8-7,2j причем перед эпюированкем гель с ancop6HpoBajiHOH. катапазой промывают водой с последующим отделением его от воды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Havemann R., SchiEEerН., Hepmet Н ., .„Sine methode zt/r isoEierungvon kataEase aus finde-r Eebep ohne onv/etid u-ndoj gariischen Eosun smittee.z.Phystoe. Chetn 215,229,1961.

2.Авторское свидетельство СССР №410083, кл. С O7;G 7/О28, 1972.

3.Авторское свидетельство СССР NO 353956, кл. С 122 13/1О, 1971. раствором одноосновного фосфорпоклюлого калия. Затем элюат отделяют центрифугированием и осадок геля промывают 0,3 Л расTBOpOKi одноосновного капия. 11ро.,,1влой раствор присоединяют к элюату. 1з попорченного-раствора, охлажденного до 2-4 С, каталазу осаждают полутор объемо- г спирта, например, этияово о с температурой,, от -4 до -6°С или изопропилового при комнатной температуре. Осадок отделяют центрифугированием, растворяют в воде и вторично переосаждают тем же спиртом, при тех же условиях. Затем осадок растворяют в воде, диализируют против воды 1 высущивают в вакууме. Выход каталазы в препарате составляет 70-75% от ее содержания в исходном растворе, активность препаратов - 600010ООО ед/мг. Формула изобретения Способ получения ферментного препарата катапазы из гриба PeniciESium VitaKfiRdopf. elB2o(i , предусматривающий адсорбцию ка- талазы на гель-фосфате кальшсч, отделение геля с адсорбированной каталазой, элюирование каталазы одноосновным фосфор} окислым калием, осау1шение фермента спиртом с последующим днапиоом я сушкой, отличающийся тем, что.с целью расширения сырьевой базы, в качестве исходного сырья используют мицелий гриба PenicUCiiKn VJtaCe PldopB.et шеа-i , при этом носпедний