Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов Советский патент 1978 года по МПК C07G7/02 

ция.приводит к сохранению активности оксидоредуктаз в иммобилизованном состоянии. Полученные препараты не требуют - добавленияв реакционную среду НАД при циклических процедурах получения продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами, что резко улучшает технологические свойства полученных препаратов. Кроме того, поскольку в волокна включают одновременно два оксидоредуктазных апофёрмента, при получении продуктов ферментативного превращения происходит рециклизация иммобилизованного НАД за счет сопряженной реакции, катализируемой вторым оксидоредуктазным ферментом, РециклизациюНАД можно про- водить не только энзиматическим путем, за счет включения в волокно второй окси- доредуктазы, но и химическим путем, ког да в волокно включена только одна оксидоредуктаза, а возвращение НАД в цикл осуществяется с использованием химического соединения. Система рециклизадии выбирается в зависимости от продукта, который желательно получить. Согласно изобретению описывается способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от НАД, с сохранением ферментами биологической активности и с улучщенными технологическими свойствами путем одновременного включения в волокна лолимера на основе триацетил- целлюлозы иммобилизованного на водораст воримом поликатионите НАД и апоферментов оксидоредуктаз. Предпочтительно процесс проводят следующим образом. Готовят водный раствор, содержащий ферменты, подлежащие включению в волок- на и иммобилизованный на поликатионите (полиэтиленимине или полилизине) НАД. Далее растворяют триацетилцеллюлозу в хлористом метилене в соотношении 1:14, и к этому раствору добавляют вышеуказанную смесь в соотношении водный раствор - органическая фаза, равном 1:7. Эмульгирование двух фаз интенсифицируют энергичным перемешиванием при О С в течение ЗО мин. Эмульсию выливают в открытую емкость выдерживаемую при ОС и ведут прядение в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуале при О С и собирают на каркасе катушки. Для удаления органических растворителей производят сушку волокон на воздухе. Полученные препараты используют многократно для получения продуктов ферментативных реакций, катализируемых оксидоредуктазами. Пример-1.В смеси буфера и глицерина (75:25) растворяют полиэтиленимин-НАД /РЕЗ-НАД/ (37,5 мг/мл, 0,63 мкмоль НАД в мл), лактатдегидрогеназу (препарат из мыщц кроликов фир- мы БоеНит е1, Mant he{fw,C mbHB концент рации 17,5 мг/мп и апаниндегидрогеназу (препарат из B.5ubt-i2is фирмыBoeltHU ек,IVla«t11ie m,QmbH) в концентрации 3,75 мг/мл. 10 г триацетипцеппюлозы (E2ul a AQ. SUchS ) растворяют при перемешивании в реакторе в 133 г хлористого ме- типена, к раствору попимера прибавляют 20 г раствора энзима и эмульгирование двух фаз интенсифицируют энергичным перемешиванием при ОС в течение ЗОмин. Эмульсию выпивают в небольшой ппа- ви.тьный тигепь, выдерживаемый при темпера уре О С и прядение ведут в атмосфере азота. Нити коагулируют в толуоле при О С и собирают на каркасе катушки. Для удаления органических растворителей производится сушка на воздухе, 2 г свежеполученного волокна, что соответствует примерно 1 г сухого полимера, промывают бикарбонатным буферным раствором с рН 8,0 для удаления непрочно связанных ферментов и РЕ О - НАД, а затем волокно помещают в 10 мл 3%-но- го водного раствора L, - лактама аммония, рН 7,4. Производят перемешивание при комнатной температуре в течение 10 ч. Далее с помощью анализатора аминокислот определяют количество образовавще- гося Ц-аланина. Оно составляет 0,163 г (96% от теории). То же волокно повторно вводят в контакт со свежим раствором лактата аммония. После 7 циклов использования процентное содержание Ц - аланина составляет 94% после 10 ч инкубации. После 33 цикла оно составляет соответственно 90%. Ц - Аланин выделяют осаждением этанолом при рН 6,2;|об} +14,6 (,0,5 н. HCt}.° Пример 2. 2г волокна, полученного как в примере 1, промьтают 0,05 М фосфатным буфером, рН 8 и помешают в 10 мл водного раствора еде дующего состава: 0,05 М фосфатный буфер, рН 8;5%-ный (вес/объем) D ,L -лак. тат аммония. Через 10 ч содержание апанина составляет 98% от теоретичес56кого. То же волокно повторно помещают в 10 МП анапогичного раствора и раствор заменяют через каждые 7 ч. Через ЗО дней непрерывной работы содержание аланина после 10-часового цикла составляет 95% от теоретического. Примерз. Вопокно готовят, как это описано в примере 1, но с заменой PED -НАД на попилизин-НАД. Реакцию ведут аналогично примерам 1 и 2. В пер вом цикпе через 10 ч содержание аланин составляет 92% от теоретического. Чере 30 дней использования достигается 87% степень превращения. Пример 4. Ферментсодержащий раствор готовят растворением компонент в смеси буфер глицерин (75:25)j РЕЗ -НАД 25,5 мг/мл (3,78 мкмоль НАД/МЛ); дегидрогеназа 3- об -2-й -оксистероида (фермент избг ерЬот сее wge rtatts фирмаБоеЬН «gev, Ма trn heiw, IТ H-j-v (- /. . .. f l f C (vnbHj/ Г2,5мг/мл (22-5ед/мл,25°С, этан в качестве субстрата); альдегиддегидрогеназа (фермент из дрожжей, фирма51 гк Sl,l,OHiB) 30 мг/мл (90 ед./мл, ацетальдегид в качестве субстрата), Волокно готовят как в примере 1. 2 г волокна, соответствующие сухого полимера, промьшают при 25С в 10 мм буферного раствора триэтаноламина (0,1 М, рН 7,3), содержащего, 0,3 М КС 2 . 5 млмоль у& -меркаптоэтанол и 1% этаноп. При этой операции под действием дегидрогеназы спирта и дегидрогеназы альдегида PEtJ -НАД превращается в свою восстановленную форму. Далее врлокно помещают в свежий буферный раствор (10 мл) того же соста ва, содержащий дополнительно 2 мг. кортизона (А 4-прегнен-17-(Хг-21-диол-3,11,20-трион). Раствор перемещивают при 25 С в течение 1 ч. Затем отделяю волокно и раствор экстрагируют 3 порциями хлороформа по 2 мл, органический экстракт концентрируют в вакууме до объема 1 мл и определяют кортизон и Д 4-прегнен-17- сс;-20- Л -21-триол-3,11-дион. Степень превращения составляет 95% Тот же образец волокна использован в 20 циклах превращения с незначительным снижением активности. П р и М е р 5. Ферментосодержащий раствор готовят растворением компонентов в смеси буфер - глицерин (75:25); РЕЗ-НАД 25,5 мг/мл (3,78 мкмоль НАД/МЛ); дегидрогеназар- оксистероида 8 (фермент из Pseudomenas testoaienoni фирма 5л та,61,Ьоп15 сорт Л), 40 мг/мл; диафораза (фермент из сердца рвиньи, фирма Boehpinger Mannheim маркаII ) 19,4 мг/мп (содержит 6,45 мг/мл энзиматического белка). Волокно готовят как в примере 1. 2 г волокна промывают буферным раствсх.ром триэтаноламина(0,067 М рН 7,6) и помещают в 10 мл того же буфера, содержащего 288 мг тестостерона (17-/5-окси-д4-андростен-3-он) и .2,9 мг 2,6-дихлорфенопиндофенола. Раствор перемещивают при 25 С при пропускании через него кислорода для окисления восстановленного красителя. Через 4 ч смесь экстрагируют тремя порциями этилацетата по 3 мл, органический экстракт сущат безводным сульфатом натрия, фильтруют и упаривают досуха. Твердый остаток растворяют в 0,5 мл метанола и определяют количество продукта Д 4-андростен-3,17-диона. Оно составляет 9О%, из расчета на исходный тестостерон. П р и М е р 6. Используется то же волокно, что и в примере 5. 1 г волокна, соответствующий 0,5 г сухого полимера промывают буферным раствором гидрохлорида триэтанопамина, 0,06 М, рН7,6. Приготовлены пять растворов, содержащих буферный раствор гидрохлорида триэтаноламина, 0,06 М, рН 7,6, 2,6- -дихлорфенопиндофеноп, 80 мкмопь и тестостерон (17/3 -окси- Д 4-андростен-3-он); 10 мкм ОЛЬ, 20мкмоль, 30 мкмоль, 40мкмольи 50мкмоль. 1 гпромытого волокна помещают в 5 мл каждого раствора и смеси перемешивают при 25 С, измеряя оптическую плотность при длине волны 600 нм. Построена калибровочная прямая, на которой откладьгаают разности оптической плотности. То же волокно повторно использовано для определения тестостерона в растворе, который содержал его в концентрации 30 мкмоль. Во время ста отсчетов отклонений от калибровочной кривой не обнаружено. Формула изобретения 1. Способ иммобилизации оксидоредуктазных ферментов, зависимых от никотинамидадениндинуклеотида (НАД) путем включения их в волокна полимера на основе триаце«тилцеллюлозы, отличающийся

76180488

тем, что, с целью сохранения активностипопикатионитами явпяются попиэтиленимин

иммобилизованных оксидоредуктаз, осу-и- попипизин.

ществпяют одновременное включение вИсточники информации, принятые во

вопокна иммобилизованного на водораст-внимание при экспертизе:

воримом попикатионите НАД и апофермен- 51.3 iinioblEi2,ed El1z flЦeз,0,T.2:olЪorlSK(,

тов оксидоредуктаз.CTRC Pfess , i9T4.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю-2. Патент ССОР №364173, кл.

щ и и с я тем, что водорастворимыми покл,. 3D 01 о 1/10, 26.06,68.