Изобретение относится к способу получения антибактериального вещества, образующегося при выращивании культуры микроорганизма Vocar dl а 5р. № 5646.
Известны способы получения антйбакте риальных веществ путем выращивания продуцентов из различных культур микроорганизмов в питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли, с последующим выделением целевого продукта общеизвестными приемами ll.
Целью изобретения является получение нового эффективного антибактериального вещества, расширяющего арсенал извест ных антибактериальных средств.
Поставленная цель достигается тем, что культуру микроорганизмаNoCQfd(О Sp. U № 5646 выращивают в водной питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях в течение 45-240 ч с последующим выделением целевого продукта с помощью
ионообменной колонки в виде смеси или отдельных фракций.
Целевой продукт выделяют в виде альфа-, бета- или гамма- активных фракций.
Новые антибактериальные срюдства обозначены: ВМ 123об, ВМ 123у5 и ВМ 123, Штамм-продуцент нового антибиотика выделен из образца почвы в Оцеола (Айова) и хранится в коллекции культур Американ цианамид компан , Пирл Ривер, Нью-Йорк, под номером ВМ123. Жизнеспособная культура нового микроорганизма хранится в CuEtute CoBEection Laboroilorv,NoflVtetn UiiSizaiiort Research attd DeveEopineHt Б visiorts,United States De jariawent Q Agt.cu2iure,peoriq, :)EEitto/s, под номером 5646,
Культуральные признаки штамма приведены в табл. 1.
Физиологические признаки штамма приведены в табл. 2.
Данные об утилизации штаммом источников углерода приведены в табл.3.
Таблица
Продолжение табл. 1
Следы
Умеренный
Примечание: 1. Инкубация 14 дней, 32 С
2, Рас-творимые пигменты не образует.
Желатина
14
Бульон с органическим нитратом7
14
Пептоновый агар
24-28(ч)
с железом
Пурпурное молоко7
Дрожжевой экстракт, агар + хлористый натрий (4,7.10 и 13%ный)
От бесцветного до желтоватого
Т а б л и ц а 2
Незначи- Не разжижает тельный
ХорошийТо же
В осе танавливае т нитраты в нитриты.
То же
М еланиновый
Хороший пигмент не образуется
Отсутствие пептонизации или створаживания
Переносимость к хлористому Р1атрию 4%, но -i 7%
618О53
3 - хорошее использование, 2 - удовлетворительное, 1 - слабое, О - не используется.
Химический состав. Микроорганизм относится к клеточной оболочке типа IY т.е. содержит меао-2,6-диаминовимелиновую кислоту и по относится к Типу А, т.е. содержит арабиноэу и галактозу. Метвлировавный экстракт клеток обнаруживает при газовой хроматографии картину жирных кислот, аналогичную
продуцируемой Wocahdiа ofsieTOitJes
AVtC № 3308.
Микроморфология. Воздушный мицелий вырастает из мвиепиального субстрата в виде слаборазветвленных умеренно ддннвыхнзвилисплх элементов, обычно заканчивающихся удлиненными примитив8ТаблицаЗ
ными спиралями. Извилистые элементы неравномерно сегментированы на короткие эллиптические - цилиндрические секции, легко расчленяющиеся. Спиральные конечные части сегмеитарованы менее заметно. Размер сегмеятш обьино в интервале 0,8-1,7 X О,3-0,5 ммк, в среднем 0,4 ммк х 1,2 ммК.
Эксперименты с предварительным выделением тонкослойной и бумажной хроматографией показали что в процессе аэробной ферментации Нос CS(«cJi а Bp. № 5646 продуцируются по крайней мере три антибиотикаг БМ123 ct , ВМ123 А л ВМ123 у . Изучение питательных сред выявило наличие двух типов питательных смесей: типа гамма, продуцирую щей, в основном, ВМ123 у с небольшими количествами ВМ123Й и ВМ123 Ol и типа альфа, продуцирующей в основном ВМ123 oi , Процесс ферментации идет главным образом, в нецфавлении избирательного продуцирования ВМ123 альфа. ВыращиваниеMocardia Sp. 564 можно проводить в различных жидких культуральных средах. Среда, пригодная для продуцирования новых антибиогаков, включает; ассимилируемые источники углерода, такие как крахмал, сахар, меласса, глицерин и т,п; ассимилируемые источники азота, такие как протеин, гидролизаты протеина, полипептиды, аминокислоты, замочная жидкость ржи (кукурузы) и т.п.; и неорганические анионы и катионы, такие как калий, натрий, кал ций, сульфаты, фосфаты, хлориды и т.п. Микроэлементы-бор, молибден, медь и т, п. вносятся в виде следов или примесей других компонентов смеси. Процесс ведут при аэрировании (в танках и баллонах) стерильным воздухом через массу или на поверхности ферментативно среды. Необходимо также механическое перемешивание в танках. При надобности можно внести противовспенивающее средство , например лярд. Для получения ВМ123 od инокулум Uo Sp.MRRbW 5646 для колб-ка-. чалок получают инокуляцией 100 мл стерильной жидкой среды следующего состава, г: Мясной экстракт3 Бактотриптон5 Дрожжевой экстракт5 Крахмал.24 Декстроза1 Водадо 100О(м рН среды доводят едким натром до 7,0 Колбы или матрацы (емкостью 5ОО м инкубируют при 25- предпочтитель но , и энергично перемешивают на ротационной качалке 30-48 ч. Отбирают порции по 100 мл прививочного материа ла и инокулируют 1 л и 12 л той же ср в 2-х и 20-литровых стеклянных ферментерах. Инокулированную смесь аэрируют стерильным воздухом в процессе роста в течение 4О-55 ч. Эти партии инокулума используют для и)1окуляции танков-ферментеров. Для продуцирования ВМ123 л в танке-ферментере используют среду следующего состава, г: Бактопептон1О,О Декстроза10,0 Меласса2 О, О Железо-аммоний лимонно-кислый0,1 Карбонат кальция1 О ВодаДо 100О(мл) Танк инокулируют 3-10% вышеполученного инокулума. Аэрацию проводят из расчета 0,2-0,8 л стерильного воздуха на 1 л бульона в минуту, и ферментационную смесь перемешивают мешалкой при 50-200 об/мин. Температуру поддерживают 25-29 С,. предпочтительно 28°С. Ферментация длится 180-24О ч. По окончании ферментации отфильтровывают ферментационную массу, содержащую BM123oi , предпочтительно при помощи диатомовой земли или других обычных фильтровальных вспомогательных средств. Обычно мицелиальный пирог промьшают водой и объединяют фильтрат с промывной жидкостью. Объем фильтрата составляет с среднем 30 л. Доводят рН до 6,5, добавляют фтористый натрий, и смесь перемешивают около часа. Образовавшуюся суспензию фильтруют, например через диатомовую землю. Фильтрат перколируют через колонку с - 5О (No) (50-100 меш) со слабокислой смолой (выпускаемой фирмой Ром и Хаас, Филадельфия, Пенсильвания) с объемом слоя в 1 л. Колонку со смолой промывают 4 л воды.ВМ123 ой элюируют, пропуская через 1 олонку О,3н. серную кислоту. Элюат собирают во фракции обшим объемом 5ОО мл. Фракции 1-7, содержащие действующее начало ВМ123л объединяют и доводят едким барием до рН 7,2. Образовавшийся сульфат бария отфильтровывают, получают прозрачный фильтрат. Этот фильтрат пропускают через колонку с - 50 (Н ) с объемом слоя в 65О мл. Колонку промьшают водой и элюируют по вышеописанному методу 0,3 н. серной кислотой. Активные фракции (1-7) также доводят - при помощи едкого бария - до рН 7,0 и от фильтровьшшот получают прозрачный фильтрат. Этот раствор упаривают под Вакуумом для последующей хроматографии на угле. Гранулированный Дарко С-60 (2О-40 меш) суспендируют в воде, переносят в стеклянную колонку и отстаивают, сливают избыток воды и концентрат ВМ123а; медленно пропускают в колонку. Загруженную колонку промывают водой и проявляют 5О%-ным водным метанолом, собирая фракции по 5О мл. Объединяют активные фракции 116 (18-68), (водный слой) упаривают под вакуумом, лиофилизируют, получают белый твердый остаток . Дополнительное количество ВМ123 х можно извлечь дальнейшим про$тлением 1 блонки с углем 50%-ным пЬдкисленным водным метанолом (рН 1,8, серной кислотой), получая дополнительно 16 фракций. Кислые .фракции объединяют, упаривают под вакуумом (до водной фазы), доводят рН едким бариемдо7,2, фильтруют и лиофилизируют. ( При ферментации для избирательного продухщрования в основном ВМ123/Э и ВМ1231 приготовление инокулума производят так же, как для . Для получения ВМ123 jj в танке-фер ментере обычно используют среду следую щего состава, г: Декстроза1О,0 Мясной экстракт4,0 Бактопептон4,0 Хлористый натрий2,5 Дрожжевой экстракт1,0 ВодаДо 1ООО(мл рН доводят едким натром до 7,О. . Танк инокулируют 3-10% полученног инокулума. Аэрируют из расчета 0,2-0, стерильного воздуха на 1 л бульона в минуту, ферментацишшую смесь перемешивают мешалкой (50-2ОО об/мин). Температуру поддерживают С, обычно около 28 С. Продолжитйльность ферментации 45-85 ч. Отфильтровывают ферментационную массу, содержащую ВМ123 5 и ВМ123 используя в качестве фильтровального вспомогательного средства ,1% диатомов земли. Пирог промьшают водой. Фильрат объединяют с промывной жидкостью и пропускают через 10- литровый слой 5О ( ) под действием тяжести, со скоростью потока 330 мл/мин. Загруженную колонку промътают водой. Действующее начало элюируют из колонки, используя 0,3.н. серную кислоту. Элюат собирают в две порции. Первая порция содержит элюат с рН 7,0-5,0. Первую порцию отставл аот из-за высокого содержания соли, вторая порция имеет рН около 1,4. Эту кислую порцию доводят едким барием до рН 6,0. Образующийся сульфат ба-. рия отфильтровьтают через диатомовую землю. Пирог промьшают водой, объед няют фильтрат с промы юй жидкостью и упаривают под вакуумом. Концентрат нагревают на паровой бане до 50 С и вносят в горячий раств.ор соли Рейнеке {150 г на 1500 мл при 75°С). Горячий раствор оставляиот на 48 ч, затем отфильтровывают, получают пурпурно-красное твердое вещество. Его промывают водой. Влажное твердое вещество перемешивают со смесью воды и бутанола-1 (2:5) и доводят рН до 1,5 при помощи 0,25 н. серной кислоты. Смесь отфильтровывают,, и водную фазу фильтрата доводят до рН 6-8, вновь фильтруют и второй фильтрат упаривают под вакуумом. Концентрат пропускают через колонку со 1ОО мл Дауэкс 1-х4 (CR) и лиофилизируют. Порошкообразную целлюлозу смешивают с верхней фазой, полученной при смешении 90%-ного фенола, хлороформа, пиридина, уксусной кислоты (в со- i отношении 15ОО : 300 : 45 : 45 : 75О). Затем постепенно загружают в стеклянную колонку, через верхнюю часть, вышеописаннуЬ лиофилизированную смесь компонентов, растворенную щ верхней фазе, и смоченную порошкообразную целлюлозу (1:2 объем/вес). Колонку проявляют под давлением воздуха из резервуара, присоединенного к верхней части стеклянной колонки. Всего собирают 75 фракций (по 25 мл каждая), используя автоматический коллектор фракций. Активность устанавливают биоавтографией бумажных кружков, высушенных на воздухе и промытых эфиром, до нанесения на большие агаровые пластины, засеянные K.pueuttlOttios, штамм AD . Наблюдаются две отдельные активггые полосы. Одна из них состоит (BM123JJ) из фракций 3-18, а вторая (ВМ123/5 ) - из фракций 31-52. Объединяют фралсции 3-18 и вносят в хлороформ, образуется двухфазная система. Нижнюю фазу оставляют, а верхнюю водную фазу (рН 4,5) дважды экстрагируют равным объемом эфира для удаления оставшегося фенола, доводят до рН 6,5 используя ЗТ 45 (ОН ), лиофилизируют и получают BM123)J . Объединяют фракции 31-52, обрабатывают их аналогичным образом и получают ВМ123 /5 . Три антибактериальных средства сравнивают Jit vH ho, используя разнообразные грамположительные и грамотрицательньхе бактерии, а также M smefiwatis методом разведения агара. Результаты в виде минимальной ингибирующей ; концентрации приведены в табл. 4. Дп.я сравнения взят 9Ульфат гентамицина. Антибактериальные вещества BM123aS, ЭМ123 |5 и ВМ123 JJ действуют in VAVO а различные микроорганизмы. Их можно использовать в качестве лечебных средств при печении бактериальных инфекций у млекопитающих путем парентерального вве дения. Эффективность новых антибактериаль ных средств доказана их способностью задерживать системные летальные инфекции у мышей. Новые вещества обнаруживают ш vivO высокую антибактериальную активность пpoтивP toietlЭ mirabiEis Атсс № 467i,K2ebsie2Ea рнеиH10«iasJttl,E. N 311 при введении pa30Boi|i дозы подкожно группам мышей
Mycobacterium smetftttoiiis °Ь01
StaphyPococcua aureus А7СС L41H
etapH Eococcus oiureus Smith АТСС 15709
SiaphyEococcue aufeus W 54050 Ъ 122-3
Baci22us cereus ATCC 634
BaciEEus gEobigii
BaciEEus sublJEis W2irstatrs2jfl -T8
BaciEEus suЫiE sЫ i8 startsFj
Coryttebacterium xenosis }}1 1БЧЪ97
Eiiiet ococcus QK
SGivciifa Euiecx ATCO 9341
Ewiejoboicier Ц275
ЕесЬе1 1сНш coEi U 311
Hscherlckia coEi №29
KEebsieEEoi piteumoniaa TypeAjStf ain
Pholeus m roibi2j6 ATCC 46Ti
Pi oteus ATCC 8019
Pt oteue vuldatis ATCC 94B4
Таблица4 Conwovlh PQrmsCFl весом по 20 г, инфицированных внутрибрюшинно летальной дозой указанных бактерий в 1О , Ю и 10 разведениях соевым бульоном {обработанным триатиказой) пятичасовой культуры крови Т&Р. Данные об антибактериальном действии irf vivoBM 123 оС ,jb и у приведены ,в табл. 5. В контроле - инфицированные , но необработанные антибактериальными средствами животные.
Продолжение табл. 4 Вещества можно вводить в различны фармацевтические формы, например, в инъекционные растворы, таблетки, капсулы; пилюли и т.п. для непосредственн го или поддерживающего действия в сочетании с соответствующими носителями или наполнителями. Пример 1, Приготовление иноку лума. Типичную среду для выращивания пер вичного инокулума приго -авливают по сл дующей рецептуре, г: Мясной экстракт3 Бактотриптон5 Дрожжевой экстракт5 Крахмал.24 Декстроза1 Водадо 100 (мл Доводят рН едким натром до 7,0,Промытые или снятые споры с косого агара оС01Рс5ш вр. 5646 используют для инокуляции двух матрацев емкостью 5ОО которьсс находится по 100 мл вышеуказанной стерильной среды. Маараць помещают на ротацион ную качалку и энергично взбалтывают 48 ч при 28 С. Образовавшийся инокулум переносят в 5-тигалонный фермен тер (стеклянный) с 12 л стерильной среды. Аэрируют стерильным воздухом 48 ч, после чего содержимое использую для засева ЗОО-литрового танка-фермен тера со 15О л стерильной среды. Массу инокулума аэрирую стерильным воздухом из расчета 1 л воздуха на 1.л массы в минуту, -подаваемым в нижнюю часть ферментера, без механического дополнительного перемешивания. Массу выдерживают при 28 С, В качестве противовспениваюшего средства испсяьзуют лярд. После 53 ч выращивания массу инокулума используют для засева 2000-ли трового ферментера со 135О л стерильней ферментационной среды. П р и м е р 2. Ферментация WoC(Sti(|i ep. № 5646 на среде, благоприятствующей продуцированию ВМ 123 об. Приготавливают ферментационную срэду следующего состава,г: Бактопептон, 1О,О Яекстроэа1ОО,О Меласса2 О,О Железо-амм иний ЛЕ1 0НЧОКИСЛЫЙО,1 Карбонат кальния .l|fO ВодаДо 10ОО{ Ферментационную среду стерилизуют 6О мин при 1200С паром при давлений 8 кг/м. рН среды после стерилизации 6,7. 1350 л стерильной среды в 2000-лнтровом танке-ферментере инокулируют 150 л инокулума, полученного описанным в примере 1 способом. Ферментацию ведут при 28 С, использ гя в качестве пеногасителя лярд. Аэрацию ведут из расчета 0,6гО,7 л стерильного воздуха на 1 л массы в минуту. Массу перемешивают при 50 об/мин. Ферментацию ведутА ЗО ч. П р и м е р 3. Выделение ВМ 123ai. Ферментацию ведут как описано 30 л ферментационной массы с рН 7,7 отфильтровывают, используя в качестве фильтрующего вспомогательного средства 300 г диатомовой земли, пирог промывают водой, объединяют фильтрат с : промывной жидкостью {31 л) и соляной кислотой доводят рН до 6,5, вносят 62 г фтористого натра, и смесь перемешивают в течение часа. Образовавшуюся суспензию фильтруют, используя диатомовую землю в качестве фильтрующего средства, и получают 31 л фильтрата. Фильтрат пропускают через колонку с (No) (50-100 меш) с объемом слоя 1 л. ВМ элюируют, пропуская О,3 н. серную кислоту через колонку и собирая фракции объемом по 500 мл. Фракции 1-7, содержащие активный компонент, объединзшт и едким барием доводят рН до ,7,2. Сульфат бария отфильтровывают и получают прозрачный фильтрат. Его пропускают в течение ночи через колонку с it С 50 (Н ) с объемом слоя в 650 мл. Колонку промьшают 4 л воды и элюируют действующее начало 0,3 н. серной кислотой. Активные фракции {1-7) обрабатывают едким барием для доведения рН до 7,0, фильтру1бт,получают 2,9 л прозрачного фильтрата, паривают под вакуумом до 75 мл для последующей хроматографии на угле. 1 л гранулированной Дарко С-60 {2О-40 меш) суспендируют в воде, переносят в стеклянную колонку и оставляют отстояться. Удаляют избыток воды и в колонку медленно пропускают 75 мл концентрата. Загруженную ролонку промьшают 4 л воды и проявляют 3,5 л 50%-ного водного метанола, собирая фракции по 5О мл, фракции 18-68 упаривают до водной фазы под вакуумом, лиофилизируют, получают 6,4 г белого твердого вещест ва ВМ ,. Колонку с углем проявляют подкисленным водньш метанолом (рН 1,8, при помощи серной КИСЛОТЬЕ) и получают дополнительно 16 фракций. Объединяют подкисленные фракции, упаривают под вакуумом до водной фазы, доводят рН ед1сим барием до 7,2, фильтруют, лиофилизируют, получаю еще 1,5 г ВМ 123а;. Обе порции твердого .вещества пред™ ставляют, по данным тонкослойной хроматографии, смесь ой 1 и об 2, Этот ВМ 123 ct сушат 16 ч в сушилке дергальдена над кипящим этанолом, тем производят микроанализ, ВМ 123 о; не .имеет четкой точки плавления, постепенное разложение начинается около 200°с. Микроанализ,%: С 33,89; Н 5,71; N 11,88 (непосредс венно 35,40), зольность О. ВМ 123 Л пропускает свет в области 22О-34О нм в 90%-ном метаноле при концентрации 200 мкг/мл. +52 (с 1,00 в ). ВМ123 oi обнаруживает характерную абсорбцию в инфракрасной области спектра при длине волны, : 780, 815, 950, 1050, 1110, 1250, 134О, 1395 1560, 1670, 1705, 2950, ЗЗЗО. Пример 4. Ферментация с приме нением Nocafdifl Sp. № 5646 и среды обеспечивающей продуцирование ВМ123(У и BM123jf . Приготазливают ферментационную среду следующего состава, г: Декстроза10,0 Мясной экстракт4,0 Бйктопептон4,0 XnopJtCTbitt натрий2,5 Дрожжевой экстракт1,0 ВодаДо 1ООО(мл) Едким натром доводят рН до 7,0. Ферментационную среду стерилизуют 60 мин при 12О С паром под давлением 8 кг/м , рН стерилизованной среды 6,7. 1350 л стерильной среды в 2000-литровом танке-ферментере инокулируют 15О л инокулума. Ферментацию ведут при 28 С, используя лярд в качестве противовспенивающего средства. Аэрацию ведут из расчета 0,4 л воздуха на 1 л среды в минуту. Массу перемешивают при 50 об/мин. Ферментацию ведут 85 ч. П р и м е р 5. Выделение ВМ123|3 и ВМ123 . 1350 л ферментационной массы, полу ченной описанным в примере 4 способом, фильтруют, используя 1% диатомовой земли в качестве фильтрующего средства пирог промывают 50 л воды и отстаивают. Объединенные фильтрат и промыв ную жидкость пропускают через 1О-литровый слой 50 (Поп под дейст вием собственной тяжести со скоростью потока 330 мл/мин. Колонку промьшают затем 30 л воды. Активные компоненты элюируют из колонки, испситьзуя для этого 170 л 0,3 н. серной кислоты. Элюат собирают в две порции. Первая порция содержит элюат с рН от 7,0 до 5,0. Первые 45 л отстаивают из-за высокого содержания соли. Вторая порция (120 л) имеет рН 1,4. Эту кислую порцию доводят едким барием до рН 6,0, отфильтровывают образовавшийся сульфат бария, используя при этом 1 кг диатомсжой земли в качестве фильтрующего средства пирог промьшают 5 л воды, фильтрат вместе с промывной жидкостью упаривают под вакуумом до объема 2 л. Концентрат нагревают на паровой бане до 50 С и вносят в горячий раствор соли Рейнеке (150 г в 1500 мл воды при 75°С). Горячий раствор оставляют на 48 ч при комнатной температуре, затем фильтруют и получают твердое вещество краснолилового цвета, которое промывают бООмл воды Влажное твердое вещество перемешивают с 2 л воды и 5 л бутанола-1, доводят рН до 1,5 при помоши 0,25 н. серной кислоты.Смесь отфильтровьшают и водную фазу фильтрата обрабатьшают твердым едким барием, доводя рН до 6,5.Смесь отфильтровьшают и упарив.ают под ваKyyMQMf доводя объем до 350 мл. Концентрат пропускают через колонку (объемом 100 мл) с Дауэкс 1-х4 (С1 ), лиоянышзируют и получают 50 г продукта. - . 25О г порошкообразной целлюлозы смешивают с 200 мл верхней фазы, полученной при смешении 9О%-ного фенола, хлороформа, пиридина, уксусной кислоты, воды (1500:300:45:45:750 по объему). Затем через верхнюю часть колонки загружают смесь 10 г лиофилизированнсьго прояукта в 16 мл верхней фазы и 2О г уБлажненной порошкообразной целлюлозы, Колонку проявляют, используя воздух под давлением 0,2 кг/м из резервуара, присоединенного к верхней части стеклянной колонки. Собирают 75 фракций по 25 мл.. Активность устанавливают биоавтогра- фией смоченных бумажных кружков, вы- . сушеи1и.1Х на воздухе и промытых эфиром, до нанесения на большую агаровую пластину, , засеянную K.pMSutKOttficiS штамм AD . Наблюдаются две отделыпзхе активные полосы. Одна из них (BM123J) состоит из фракций 3-18, а вторая (ВМ123 /2) ) - из фракций 31-52, Объед}шяют фракции 3-18, добавляют 140Омл хлор01форма, получают двухфазную систему. После разделения верхнюю водную фазу (рН 4,5) дважды экстрагируют ра ным объемом эфира для удаления остаточного фенола. рН водной фазы доводят до 6;5 при помощи П 45 (ОН), лиофилизируют и получают 1,62 г ВМ123 Объединяют фракции 31-52, обрабаты вают аналогично и получают 1,05 г ВМ123|15. 1 г ВМ123 перемешивают 15 мин с 20 мл абсолютного метанола, суспензшо отфильтровывают, получают ЗО5мг: твердого вещества, фильтруют, к фильтр ту приливают 6О мл эфира, получают суспензию белого хлопьевидного матери ла в эфире-метаноле, отфильтровьюают, получают белое твердое вещество и беловатый фильтрат. Твердое вещество промьтают на воронке Бюхнера эфиром и сушат на воздухе, получают 6О2 мг ВМ123 5 , сушат под вакуумом в сушильном аппарате Абдергальдена над кипящим этанолом 16 ч. ВМ123 не имеет четкой точки плавления, постепенное разложение начинается около 200 С. Микроанализ, С 46,13; Н 6,65; W 17,0 (непосред. - 24,96); зола 0,90. Соединение обнаруживает в 90%-ном метаноле максимум абсорбции в УФ-об ласти при .286 нм (), 53,8 (,004 в ). ВМ123 обнаруживает характерную абсорбцию в инфракрасной области спек тра при длине волны, см : 765, 870 98О, 1О45, 1112, 1175, 1230, 134 14ОО, 1465, 1510, 1570, 1610, 16 219О, 3333, 670 мг ВМ12313 перемешивают с 12 мл метанола в течение 15 мин, отфильтр(жьтают, в фильтрат приливают 36 мл эфира, получают белый осадок, Его собирают на фильтре, промывают эфир(Ж1, сушат на воздухе, получают 466 мг BM123jb, который сушат под вакуумом над кипящим этанолом в течение 4 ч (до микроанализа). ВМ1231Ь не имеет четкой точки пла ления, но начинает постепенно разлагаться около . Микроанализ,%: С 47,53; Н 7,39; У1 16,54; зольность 1,04. В 98%-ном метаноле он обнаруживает максимум УФ-абсорбции при 286 нм при Положение максимума не изменяется в зависимости от рН. (yiJ3)+53,2 {С 1,250 в ), ВМ123р обнаруживает характерную абсорбцию в инфракрасной области спект ра при длине волны, см : 826, 870, 922, 980, 1035, 1105, 1170, 1220, 1340, 1390, 151О, 1560, . Ч60О , 167О, 295О, 308О, 3350. П р и м е р 6. Распределение на бумаге и тонкослойная хроматография активных компонентов. Антибактериальные средства можно различить методом хроматографии на бумаге. Для этой дели на полоски ватманской бумаги №1 наносят водный или метанольный раствор веществ и уравновешивают 1-2 ч в присутствии верхней и нижней фаз. Полосы проявляют с нижней (органической) фазы, полученной при смешении 90%-ного фенола; м-крезола; уксусной кислоты, пиридина, воды (100: :25:4j-4:75 по объему). Полоски удаляют из камеры, сушат на воздухе 1-2 ч, промьшают эфиром для удаления остаточного фенола и подвергают биоавтографии на больших пластинах агара, засеянных K.ptteumottias. К.С для ВМ123 Х -0,20, 0,47; BM123fb -0,62, 0,71; BM123jf-О,88. об и -компоненты представляют собой смесь двух антибиотиков. |J компонент состоит из главного антибиотика (1-0,62), названного ВМ123|2)и меньшего компонента ВМ123 2 ( 0,71). Наиболее полярный компонент ВМ123 oi (Т 0,20) назван ВМ123й , а менее полярный ( 0,47) назван ВМ . ВМ123с разделяется на два компонента методом, основанным на тонкослойной хроматографии, на Полиграм Цел ITV 254 с тонкослойной целлюлозой, выпускаемой фирмой Бринкманн Инструменте лимитед, Нью-Йорк. Тонкослойные пластины с пятнами раствора вещества проявляют водой, содержащей 1% тринатрийцитрата. Зоны проявляют автографически на агаровых пластинах, как описано выше, в результате две зоны: ВМ123 (Л. с Rr 0,90 и ВМ123о 2 с Щ 0,65. Формула изобретения 1. Способ получения антибактериального вещества, от.личающийся тем, что культуру микроорганизма МоС01 СdiO sp. NWb № 5646 выращивают в водной питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, азота и неорганические соли, в аэробных условиях в течение 42-240 ч с последующим выделением целевого продукта с помощью ионообменной колонки в виде смеси или отдельных фракций. 2, Способ по п. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что, целевой продукт выделшот в виде альфа, бета или гамма-активных фракций. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе: 1. Патент США № 3597325, кл, 195-96, 1971.
