Способ получения клавулановой кислоты и ее солей Советский патент 1979 года по МПК C12D1/02 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КЛАВУЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ СОЛЕЙ

.2

695565

в виде CBS 177.76 ив коллекции микроорганизмов ФРГ (DS,N).

Морфологаческие признаки. При наблюдении в микроскоп серийный мицелий хорошо разЕветвлен и образует плотно уложенные спирали. Споры находятся в цепочках по 10-50 спор каждая. Споры цилиндряческие, размером 0,6-0,8X1,0-

1,2 мкм, а их поверхность гладкая. Никаких цепочек конидий не замечено. Нет спорангии или жгутиковых спор; спорофоры образованы только на серийном мицелии. Культуральные признаки. В табл. 1 показаны результаты, пюлученные после культивирования в течение 2 недель при 28 С на различных культурных средах.

,Таблица

„, ,л -.-- - f

Физиологические признаки. Растет при .18-37° С. Желатину не разжижает при .18 С. Крахмал не гидррлизует. Коагулирует молоко при 25° С 7 дней; при , 37° С молоко не коагулирует.

На тирозин-агаровой среде меланйн не образует.

На пептон-железоагаровой среде не растет. ...-.:.. .--.- ..,.-..-....-Л. -.-:.- . .„;:-,,,К,..-...,:..,„...:..

Нитратьг не восстанавливает.

Отношение к источникам углерода. Данные об усвоении источника углерода на агаровой среде приведены ниже (+ усваивает, - не усваивает):

Питательная среда, которую; можно применять для культивирования Streptomyces jumonjinensis, может содержать 0,1- 10% камплёксного органического источника азота, например; дрожжевой экстракт;

кукурузный экстракт, распительньтй белок, семенной белок, гидролизаты таких белков, гидролизаты молочного белка, рыбные .и мясные экстракты и гидролизаты, например, пептонь. Можно использовать такжехимйчЪские источники азота: мочевину, соли аммония; амиды, аминокислоты или их сТйёсй, например, валин, аспарагин, глутаминовую кислоту, пролин и фенилаланин. В ггитательную среду можно вводить

углеводы (0,1-5%). Можно также применять крахмал или гидролизаты краШала, например,, декстрин, сахарозу, лакто1зу или другие сахара, или глицерин или его сложные эфиры. Источники углерода могут

быть производными растительных масел или жироб животного происхождения. В качестве источника углерода для роста к получения ингибиторов беталактамозы можно вводить карбитовьте кислоты и их

соли.-Для регулирования пенообразования не которых сред в ферментерах необходимо добавлять антипенные прнсадки, например, «Плюроник LSI.

К среде, описанной выше, можно добавлять минеральные соли, например, хлориБакто-декстроза (Дифко)4,0 Растворяют Б .дистиллированной воде, доводят до рН 7,3, а затем добавляют 20 бакто-агар а.. Проросшие микроорганизмы, взятые с поверхности этого агара, использую т неносредственно для янокулированйя 100 мл посевной среды, содерйсащейся в 500 мл конических колбах, закрытых пробками из пенопласта. Состав посевной среды, г1л: Триптон (оксоид)/5,0. Дрожжевой экстракт3,0 Среду стерилизуют перед инокулированием путем выдерживЬнйя.в автоклаве под давлением 1,055 кПсм при 121° С 15 мин. Микроорганизмы после посева выдерживают в термостате при 26° С 65 ч на роторном вибраторе при 240 об/мин. Порции по 5 жл посевной среды используют для инокуляции порций по 100 мл ферментативной среды, содержащейся в конических колбах емкостью 500 мл, закрытых пробками из пенопласта. Используют три разные ферментатив-. ные среды следующего состава, г/л: А. Глюкоза ,20,000 Соевая мука10,000 СаСОз0,200 /Na2SO40,500 , coCbPOi бНгО0,001; Разбавляют дистиллированнойводой. Б. Декстрин ,55,0 Соевая мука .20,0 Меласса20,0 NaHsPOi 1,3 КС11.0 Разбавляют дистиллированнойводой. Диамет Образцы на четвертый день фержента ции наносят в виде пятна на полосу хроматографической бумаги (ватман № 1) ши-. риной 1 см. Эти полосы подвергают хроматографии в течение ночи при 4° С в следующей системе растворителей:, н-бутанол-этанол-вода 4:1:5 .(по объему; легкая фаза); tt-бутанол - уксусная кислота -вода 12 : 3 : 5 (по объему). Ленты высущивают и кладут на чашки с агаром, засеянным Klebsiella aerogenes NCTC 418 и содержащим пенициллин G (пластины KAG). После выдерживания чашек в Термостате в течение 16 ч при 28° С просматривают зоны ингибирования роста. В. Дрожжевой экстракт (6ксоид) 10 Скотазол20 Разбавляют дистиллированной водой. Доводят значение рН до 7 перед стерилизацией. Все ферментативные средь стерилизуют перед засевом в автоклаве под давлением 1,055 кПсм при 121° С 15 мин. Колбы для ферментации выдерживают в термостате при 26° С на роторном вибраторе при 240 об/мин. , Образцы по 5 мл удаляют из ферментационных колб в стерильных условиях на второй день ферментации и обрабатывают следующим образом. Образцы центрифугируют при 2200 g 10 мин и верхний слой сохраняют. Верхний слой обладает ингибиторной активностью в отношении препарата бета-лактамазы (Е. соН .JT4) с применением стандартной методики определения нилибирования бета-лактамазы. Пример 2. Sir. jumonjinensis NRRL 5741 выращивают в А, описанной в примере 1. Образцы подвергают через определенные интервалы процессу ферментации в стерильных условиях. Верхний слой получают центрифугированием этих образцов при 2200 g за 10 мин и подвергают анализу на антибактериальную активность пр отношению к Klebsietla aerogenes, а с применением диффузии пластинчатого агара с отверстием - и на активность по отношению к агаровой системе KAG 1. Результаты анализов приведены в табл. 2. -. 1 Табл.ица 2 , . ; .- ы (мм) при продолжительности В обеих системах растворителей наблюдается, одна зона ингибирования при 0,72 в системе бутанол - уксусная кислота - вода и при Rf 0,25 в системе бутанол - этанол -. вода. Величины Rf одинаковы с Rf идентичных клавулановых К1Ислот, прошедших испытания в такой же системе. -; Пример 3. Streptomyces jutnonjinensis NRRL 5741 в.ыращивают 7 дней пр;И 26° С на твердом косом агаре, помещенном, в бутыли. В качестве агаровой среды используют бакто-дрожжевой агар, содержащий солодовый экстракт. В бутыли вводят 100 мл стерильной деионизированной воды, содержащей 0,05% стый натрий, хлористый калий, хлористый магний, хлористый цинк, хлорное железо, сульфат натрия, сульфат двухвалентного железа, сульфат магния, а также натриевые или калиевые соли фосфорной кислоты; в качестве; источника ионов двухвалентного кальция или для создания буфера можно вводить карбонат кальция. Можно также включать соли микрюэле(мейтов, например, никеля, кобальта или марганца. При желайии можно добавлять витамины. ИспоЛьзуемый в данном тексте .термин «мутант означает любой мутантный штамм, который повышает спонтанно или бе;спрепятственно влияние на|ружного средства независимо от того, вводится ли это средство умышленно или иным образом. Культивирование Streptomyces jumonjinensis обычно проводят при 16-35° С или 25-30° С, в частности при 27° С, и рН от 5 до 8,5, предпочтительно от 6 до 7,5. Культивировать можно в сосудах (в стеклянных конических колбах) при перемешивании (при взбалтывании на роторном вибраторе) илив аэрированных ферментеpax, например, в ферментерах из нержавеющей стали, снабженных перегородками, в которых перемешивание осуществляют с помощью лопастных дисковых импеллеров, а аэрирование - с помощью барботеров. Ферментацию можно также осуществлять непрерывно.. Исходное значение рН процесса ферментации обычно 1:оставляет 7,0, а максимальный выход клавулановой кислоты получают при 20-32° С в течение 1 - 10 дней, преимущественно 2-5 дней. Перед выделением клавулановой кислотьги ее .солей из ферментационной среды сначала удаляют клетки 5/г. jumonjinensis NRRL5741 фильтрованием или центрифугированием. Далее культуральную жидкость охлаждают, нацример, от О до -5° С, доводят значение рН до 2-Зи экстрагируют из нее клавулановую кислоту сначала органическим растворителе.м, не смешивающимся с водой, а затем водным раствором бикарбоната натрия, буферным раствором гидрофосфата калия, карбонатом калия или водои при нейтральном значении рН. Клавулановую кислоту из культуральйой жидкости можно экстрагировать такйш;смесью органического растворителя и водонерастворимого , щЪлочного металла, Например, лития. ,.; Вы 1еление солей клавулановой кислоты осуществляют путем использования ионообменной хроматографии на колонках. Культур а ль1-1ую жидкость пропускают через смолу, имеющую полиалкинрвые или четвертичноаммониевые группьт, до насыщения смолы клавул ановбй кислотой с последующим элюированием соли водным солевым раствород, особенно с кпользованием «Изопора, «Деацидита FFIP SPA64 или «ДЁАЕ-целлюлозы. Колонку, заполненную «Деацидитом, можно постепенно элюировать водным раствором соли, например, хлористого натрия (0,5М). Колонку с «ДЕАЕ-целлюлозой в 0,01М фосфатном буфере при рН 7 можно элюировать раствором хлорида щелочного металла, например, хлористого натрия 0,2М в 0,01М фосфатном буфере. Выделение солей клавулановой кислоты проводят также путем пропускания культуральной жидкости через угольнБ1й слой с последующей промывкой фильтрата водой и элю.ированием ацетоном. Активные фракции определяют по их активности ингибирования бета-лактамазы и i;o их активности в отцошении системы кАсщ:. Полученные активные фракции соединяют, концентрируют до небольшого объема под вакуумом и обессоливают. Отделение клавулановой кислоты и/или ее солей от неорганических солей и других, примесей можно осуществить путем адсорбции антибактериальных средств линофильной сйолой,. на которой неорганические соли не адсорбируются, например, сонолимером полистирола с дивинилбензолом типа «Амберлит ХАД-4. Целевой антибиотик можйо удалять из колонки элюированием. Элюирование осу- . ществляют водой или водным алканолом, и полученный раствор концентрируют упариванием и лиофильной сушкой до получения материала улучшенного качества. Отделение клавулановой кислоты и/или ее солей от неорганических солей 1можно также с успехом осуществлять хроматографией на колонке, заполненной средством для фильтрования через гель, например, сшитыми декстрановыми гелями, такими, как .«Сефадекс G 15 и полиакриламидными гелями типа «Биогель Р2.; АКТИВНЫЙ обессоленный материал можно подвергать дальнейшей очистке хроматографией, например, на колонке, заполненной целлюлозой, с применением водноспиртовой системы растворителей, например, системы бутанол -этанол- вода в объемном соотношении 4:1:5 в качестве легкой фазы. Клавулановая кислота или ее соль, получаемые при таких реакциях, обладают хорошей степенью чистоты, например, не . менее 93%. Пример. Streptomyces jumonjinensis, NRRL 5741 выращивают в течение.7 дней на твердом, косом агаре следующего состава, г/л:. Бакто-дрожжевой экстракт (Дифко)4,0 Бакто-солодовый экстракт (Дифко) 10,0 tpHTOHa X (поверхностно-активное вещество), производят соскоб с поверхностй Культурыи получают суспензию опор и мицелйЯ. 100 жл суспензии используют для посева среды 50 л, содержащейся в ферйентере из нержавеющей стали с перегородками общей мощностью 90 л. Примеряют посевную среду следующего состава, г/л;. Триптом (оксоид)5,0 Дрожжевой экстракт (оксоид) 3,0 Антипенный агент0,5 : Разбавление производит водопроводной водой. Антипенный агент состоит из 10% «Плюроник L81 («Южин Кулманн Кемикэлс Лтд.), диспергированного в соевом масле («Бритиш Ойл энд .Кэйк Милдс)., Перед посевом среду стерилизуют паром в ферментере. После посева продукт перемешивают с применением лопастной дисковой (мешалки диаметром 12,7 см, вращающейся со скоростью 240 об1мин, подают стерильный воздух со скоростью 50 л/мин .vi поддерживают температуру 26° Ст-Рост посевной культуры продолжается 48 ч. 7,5 л полученного продукта используют для засева 1504 ферментативной среды, Содержащейся в ферментере из нержавеющей стали емкостью 300 А имеющем перегЪродки. На.стадии ферментации применяют среду следующего состава, г/л: Моногидрат глюкозы20,000 . Соевая мука10,000 СаСОз0,200 CoCls бНаО0,001 iNa2SO40,500 Антипенный агент0,500 Разбавляют водопроводной водой. Анттипенный агентиспользуют такой же, каКвсреде для засева. Среду стерилизуют паром в ферментере перед засевом. После засева ферментативную среду перемешивают с применением лопастной дисковой мешалки диа;метром 21 см, работающей со скоростью 340 об1мин, вводят стерильный воздух со скоростью 150 л/мин и поддерживают температуру 26° С в течение ферментации, проводимой 72 ч. Цельный отвар осветляют центрифугированием. Осветленный отвар 140 л доводят до рН 6,2, пропускают через сильноосновную анионообменную смолу «Церолит FF SRA 61 (15X30 см) со скоростыЬ 50Q мл/MUfi. Колонку промывают охлажденной деминерал|изованной водой (15 л) со скоростью потока 500 мл1мин, а затем элюируют охлажденным 1М раствором хлористого натрия с такой же скоростью потока и собирают фракции 4 л. Фракции просматривают С применением нулевого полозйенйя в метОдике биоанализа в чашках аистемы KAG. Фракции (2-19), показываю1цие хорошую активность на системе KAG, соединяют. Доводят значение рН соединенных фракций до 6,2, затем фракции (охлаждают и пропускают через колонку с «Амберлитом ХАД-4 (30X125 см) со скоростью 500 мл/мин. Колонку промывают охлажденным 1М. раствором хлористого натрия (5 л), а затем элюируют Деминерализованной водой прн 5° С со скоростью 500 мл/мин. Фракции 5л собирают, начиная непосредственно перед полным элюированиём хлористого натрия и§ колонки. Фракции. 3-9, содержащие клавулановук) кислоту, соединяют. Соединенные фракции 35 л концентрируют путем 10-кратного обратимого осмоса. Рециркулируют остаточный цродукт из емкости, выполненной из нержавеющей стали, снабженной охлаждающей системой с наружным клапаном, ведущим к установке для ультрафильтрования, с получением разности давлен/ий для 40 мембран составляющей 45 атм. Поддерживают температуру 2-5° С рН 6,8 ±0,1 добавлением 2 н. раствора соляной кислоты. Полученный концентрат (3,5 л) высуЩивают с получением бурого аморфного твердого вещества (34 г). 2 г материала, полученного как описано выще, растворяют в 25 мл дистиллированной воды и наносят на слой размером 38 л«л4Х406 мм пермутитОвой смолы FFIP (SRA 62) в виде хлорида. Колонку элюируют 1|утем гравитациОнной подачи 0,5М хлористого натрия в смесительный резервуар с 1 л дистиллированной воды, откуда его подают в хроматографическую колонку. Собирают 10 мл пробы и определяют -лактамазную ингибиторную активность, используя 1/2500 разбавление фракций. Активность элюируют п01сле основной полосы цвета между фракциями 24 и 30. Активные фракции смешивают и;концентрируют до 30 мл. Этот раствор обессоливают, используя слой - 51 . мм из биорад биогеля и элюируют 1% tt-бутанолом в воде. 20 мл фракции исследуют на содержание клавулановой кислотьт, используя определение ингибирования р-лактамазы. Фракции также наносят в виде ггятен на бумажные полости и опрыскивак)т либо реагентом Эрлиха, либо трифенилтетразолевым реагентОм, при этом р-лактамазная ингибиторная активность коррелирует с разовыми или с красными пятнами соответственно, даваемыми этими реагентами. Активные фракции смешивают, исключая те, которые содержат хлористый натрий, и концентрируют под вакуумом, получая частично очищенную натриевую соль клавулановой юислоты. Тонкослойная хроматография (силикагель) этого препарата клавулановой кислоты лает следующие зиачения Rf: я-бутаНОЛ - этанол - вода 4:1:5 (объем/объем) верхняя фаза - 0,37; н-бутанол - уксусная кислота - вода 12 : 3 : 5 (объем/ объем)- - 0,44; изопропанол - вода 7:3 (объем/объем) - 0,78. Зоны выявляют путем опрыскивания реагентом Эрлиха. 6-Аминопенйциллановая фракция имеет значения Ri 0,38, 0,39 я 0,77. .. Величину сравнивают с величиной / идентичного бензилклавуланата, хроматографируемого в таких же условиях (реактив-хлористый трифенилтетразолий - приготоцляют смешиванием 1 ч. 4%-ног6 раствора хлористого тр1ифенилтётразолия в метаноле с 1 ч. 1 н. раствора едкой щелечи).. - фракции 30-45,содержащие бензилклавуланат, сбеднняют и упаривают -при пониженном давлении с получещем маслянистого остатка. I,. Т, ... Продукт, пропуш;енный через колонку с «Сефадексом LH 20, ;paeflfOffffci C| 5 HHмал1бном .количестве .смеси циклогексана с : этилацетатом (1 : 1) Г ffp6lT(ytiraii3T через колонку (2,5x28 сл) и оиликагелем, пригодным для трнкослойной хдоматографии, Ттодт6товлёШ уюсТ10мЬщШТа гоже растворителя. КоЛбнКузлюируЮ т Щесью циклотексДна с этилацетато1м (1:1) и 28 фракций объемом. 7 мл собирают с п6следующи У образованием фракций но 15 мл. Фракции дающие icpacHoe; окрашивание при нанесении на силнкагелевые нластины для тонкослойной хроматографии с пВследуЮщей обработкой реактивом хлористым трифён,нлтeтpaзoлиJгм, соединяют и упариватЬт при пониженном давлении. - .f Ползченное масло подвергают ЯМР- и ИК-спектроскопии. Получают спектры, тгдейтйчные полученным для стандартного образца бензилклавзланата. ----- Формула изобретения 1. Способ получения квавулановод ;кис- лоты и ее солей путем выра1цивания продуS isawSiffiss-B, I . . . ... ..12 цирующих ее микроорганизмов рода Strep t tomyces на питательной среде в присутствии источников углерода, азота и необходимых минеральных солей с последующим выделеци м и очисткой целевых продуктов, отличающийся тем, что, с целью.повышения чистоты получаемых продуктов, в качестве продуцента используют штамм Streptomyces jumonlnen$isNRRL574: i 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что перед выделениел культуральную жидкость охлаждают, доводят значение рН до 2-3 и экстрагируют из нее клавулановую кислбту сначала органическим растворителем, неомешивающнмися с водой, а затем водным раствором бикарбоната натрия, буфёрньщ, раствором гидроф осфата калия, карбонатом калия или водой при нейтральном зцачеции рН. 3.Способ поп. 1, о т,л ич а ю щ и и ся тем; чтю перед выделением nsi культуральной жидкости экстрагируют клавулановую кислоту смесью органического растворителя и водонерастворймого амина, а затем водным раствором соли щелочного металла. 4.Способ по п. 1, отличающийся тем, что выделение солей квавулановой киcлoт ы осуществляют путем пропускания ультуральной жидко сти через смолу, имеющую полиалкиновые или четвертичноаммондевые, группы, до насыщения смолы клавулановой кислотой с последующим элюированием соли водным солевым раствором, 5.Способ по п. 1, отличающийся тем; что вьтделение солей клавулано.вой кислоты проводят путем пропускания культуральной жидкости через угольный слой с последующей промывкой фильтрата водой и элюированием ацетатом. Источник информации, принятый во нимание при экспертизе: i Цадент Бельгии № 827926, кл. С 07 d, опублик. 1.974