Способ получения антибиотика Советский патент 1977 года по МПК C12D9/20 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

1

Изобретение относятся к области микробиологии.

Предлагаемый способ получения антибиотика является новым и в специальной и патентшж литературе не описан. Заключается он в том, что штамм Micromonospora lacustris АТСС 21975 выращивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последукшщм выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты известными приемами.

Микроорганизм, используемый для получения антибиотика, выделен из образца почвы близ озера Роджера, Коннектикут, США. Этот штамм хранится в Американском институте коллекили типов культур Рокквилл, Мд., под номером АТСС 21975.

Выращивают М. lacustris в водной питательной среде, температура 24-36° С, условия аэробные, в погруженном СОСТОЯНИИ, при перемешива.ши. Питательная среда содержит источник усваиваемого углерода, такой как сахара, крахмал, глицерин и меласса, источник органического азота - казеин, ферментативная вытяжка казеина, мясная мука, пшеничная ю.ейковина, мука хлопкового семени, соева 1 мука и мука земляного ореха. В качестве стимуляторов роста Moiyr быть использованы

дистшшяторш-ю дисперсии или дрожжевой экстракт, а также соли, например, хлорид натрия, ацетат аммония, сульфат аммония, фосфат натрия я следы минеральных веществ, таких как железо, магний, цинк, кобальт, марганец.

Если во время ферментации происходит избыточное вспенивание, то в ферментационную среду добавляют антивсленивающие агенты, растительные маета или силиконы. рН ферментации должно оставаться постоянным, но если нроисходит изменение, то к среде дс авляют буферный агент (карбокат кальция). Азрацию среды в резервуарах для выращивания в погружетюм состоянии поддерживают на уровне 1/2 до 3 объемов свободного воздуха на 1 объем бульона в минуту. Во время переноса микроор анизма в течение его росга поддерживают асепти«ские уоЛОВИ Т.

Ферментацию ведут от 24 ч до 4 дней. Во время процесса ферментации производят биологические анализы бульона с применением штамма Staphylococcus aureiis.

Смесь антибиотиков анализируют тонкослойной хроматографией. Расщеплеш е компонентов смеси зависит от содержащихся в ней антибиотит

ков. Малая активность антибиотика не позволяет обшружить второстепенные комяонентьг, большая активность - ведет к эффекту торможения с плохим разделением.

Антибиотики, присутствующие в антибиотической смеси, окрашиваются в различные оттенки оранжевого, желтого и розового цветов.

Компоненты смеси извлекают из ферментационного бульона при помощи экстракции растворителями и хроматографкческого разделе1шя ш колонке. Для экстрагарования антибиотиков из ооетлешюго бульона применяют различные органические растворители. Эффективным растворителем является метшшзобутилкетон. Экстракцию растворителем проводят, используя объем растворителя равный 1/5 сйъема бульона, из которого извлекают смесь антибиотиков.

Анамиданы раэделяня и изолируют в вбйстановленном состоянии. Для юс восстановлешгя добавляют 2 г аокорбйшвой кислоты на I г смеси антибиотиков в бульон перед фильтрацией и перемешивают 30 мин при комнатной тешгературе.

Сепарацию и извлечение компонентов смеси антибиотиков осуществляют сяедуюащм образом. Осветвленный бульон доводят рН от 4,0 до 4,5 и экстрагируют половиной объема метилизобугалкетонд. Кетон удаляют в вакууме и заменяют промьшшенным этанолом. Раствор этанола обезжиривают повторной экстракилей нетролейным зфиром. Ансамицины восстанавливают аскорбиновой кислотой, этанол удаляют в вакууме, и остаток подвергают хроматографии на колонке из силикагеля с использованием этилацетата с увеличивающейся концентрацией ацетона в качестве проявляющего растворителя. Фракщш с колонки подвергают тонкослойной хроматографии и биоанализу.. Ак-швные фракции комбинируют. Основтя фракция элюируется и концентрируется.

Антибиотеческие продукты можно получать при помощи М. lacustris в разбавленной форме, в виде неочищенных концентратов, а также очищенных компонентов. Все они могут быть использованы для борьбы с микроорганизмами, такими как Mucobacteriuh) tuberculosis, Dipiococcus streptococcus, pyogenes и Staphytococcus, включая штаммы, которые устойчивы к другим известным антибиотикам. Их можно применять в качестве дезинфицирующих веществ, для ошстки смешанных культур, .для медищгаской диагностики и биологических исследований.

Антибиотик ВОДЯТ животным и людям через рот или парэнгеральным путем для лечения пневмококковых, стрептококковых, туберкулезных и других инфекций, чувствительных к антибиотикам. Дозировка при приеме внутрь через рот 0,5-1,0 г в день, при парэнтеральной инъекции 100-500 мг в зависимости от типа и остроты инфекщш и веса.

Он может применяться в виде таблеток, содержащих различные наполнители, например, цитрат

«атрия, карбонат кальодя и вторичный фосфат калыХия, вместе с дезинтегрирующими веществами, такими как крахьил, альгиновая кислота, и некоторыми комплексными силикатами и связыБающими агентами, например, поливинилпирролвдоном, сахарозой, желатином и смолой акации. Применяют также смазывающие агенты, такие как стеарат мапшя, лаурил сульфат натрия и тальк.

Дяя введения в рот могут быть использованы водные суспензии или злексиры, в которых основной активный ингредиент комбинируется с различными подслащающими или ароматизирующими агентами, окрашивающим веществом или красителем.

Для парэнтерального введения изготавливают растворы антибиотика в кунжутном масле или масле земляного ореха.

Пример. Готовят стерильную водную среду; имеНицую сяейу1ощий состав, г/л; 0 Крахмал20,0

Ферментативная вытяяоса казеина5,0

Дрожжевой экстракт5,0

Декстроза10,0

5КгНРОч0,5

СаСОз4,0

Клетки из М. lacustris АТСС 21975 переносят в даз литровые колбы Фернбака, каждая из которых содержит 1 л среды, и встряхива0 ют в течение 3-4 дней при 28° С.

Около 1% (об./об.) выращенного инокулума переносят в ферментер с 45000 ft стерильной водной среды описанной вьпле. Поддерживают температуру 30° С, аэрация 1/2 объема воздуха на объем

5 бульона в минуту и перемещивание со скоростью 600 об/мин. При вспенивании добавляют соевое масло для регулирования избыточного вспенивания. Через 50-60 ч 5-10% объема этого инокулума переносят в ферментер с 45000л стерильной.водной среды выщеописанного состава, но без мясной муки. Температуру поддерживают 30° С аэрация со скоростью 1/2 объема воздуха на 1 объем жидкой среды в 1 мин и перемецшваьше со скоростью 380 об/мин.

5Для регулирования вспенивания добавляют

соевое масло. Сахарозу или декстрозу добавляют

через интервалы в 24 ч до уровня 0,1% вес/объем.

Через 90-120 ч ферментационный бульон

фильтруют, и рН доводят до 4,0-4,5 в присутсгаии

5-10% метилизобутилкетона. Затем бульон экстрагируют 11250 л метилизобутилкетона.Экстракт растворителя концентрируют в вакууме до 1/10-1/20 объема, и рН доводят до 5,5-6,5 аммиаком или раствором Кз НЮ4.

55

Растворитель ( 9 л) удаляют в вакууме и заменяют этанолом. Раствор этанола концентрируют в вакууме до 90л, которые обезжиривают повторной экстракцией петролейным эфиром. К этанольному paciBopy добавляют аскорбиновую

во кислоту (2 г на 1 г смеси антибиотиков), и раст5вор перемешивают при комнатной температуре в течение 30 мин. Этанольный раствор концентрируют в вакууме при поддержании рН 6-7 до жидкого сиропа, которьй затем берется в хлороформ.g Раствор в хлорочгор концентрируют до сиропа, последний затем хррматографируют ка силикагельной колонке и проявляют этилацетатом, со-, держащим увеличивающиеся на 5% количества аце-JQ тона. Фракции с колонки подвергают тонкослой6ной хроматографни и биоанализу н соответственно комбинируют, л ормулаизо ретения Способ получения антибиотика, отличающий с и тем, что штамм Micromonospora lacustris АТСС 21975 вьфащивают на среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с послед5тощим выделением антибиотического комплекса и разделением его на компоненты иэвестньпл приемами.