Способ получения антибиотика Советский патент 1976 года по МПК C12P13/04 A61K31/42 A61P31/00 C12P13/04 C12R1/465 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА

I

Изобретение относится к микробнологическим способам получения антибиотиков.

Предяагают способ получения антибиотика путем культивирования Streptomyces в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, с последунхцнм выделением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой.

С целью получения антибиотика, именнцего структуру

CJ

v-.

се

U)

NlpCH-CH-C07

,

используют Streptomyces Sviceus.

Фильтрат культуральной жидкости адсорби)уют ионообменной смолой, и далее целевой продукт эпюируют.

Очистку целевого продукта производят путем хроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации.

В качестве ионообменной смолы берут смолу сульфоновой кислоты стирольного типа.

Антибиотик назван AT-125. Установили, что абсолютная конфигурация антибиотика AT-125L- -aS, 5S -«-амино- 3 -хлор - 2- изоксазолйЁ 5- уксусная кислота. .Она является амфотерным соединением и может встречаться в разных ионных формах в зависимости от значения рН окружающей среды. При низких значениях рН она существует в виде соли с кислотами, при более высоких значениях рН - в виде цвиттериона и при еще более высоких значениях рН - в виде соли с металлом.

AT-125 ингибирует рост грамположительных и грамотрицательных бактерий, таких, как Racillus subtilis, Escherichia coli. Он также действует на

различные грибы и дрожжи, например Saccharo myces pastorianus, Penicillium oxalicum, Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae. В связи с этим новый антибиотик можно применять отдельно или в сочетании с другими средствами, предупреждающими развитие или болезнетворное действие микробов, для предупреждения роста бактерий, дрожжей и грибов или сокращения их числа в различных окружающих средах. Его можно применять, например, для обработки мест разведения

шелкопряда в целях, предупреждения или умень: еыия до минимума заражений, вызьюаемых Вас I lus subtil IS.

ЯМН - спектр насьпценного раствора AT-125 в D-2 О определяли с помощью спектрометра типа Varian X-L-100. Спектр, полученный на приборе с частотой 100 Мгц, не бьш первого порядка и ясно показьшал присутствие четырех незаменяемых протонов. Протоны метилена у €4 наблюдались в виде типичного мнимого (deceptive) 5-линейного образца АВ с самым сильным сигналом при 350 гц и очевидно с дублетами при 359 и 361 гц. Соседние протоны у Cs наблюдались, как очевидный дублет триплетов, сосредоточенных при 5,36 б с раотределением линий при 3,5-10 гц. Сигналом протона метиновой группы аминокислоты был дублет первого порядка при 4,12 5 сЛ 3,5 гд. ИК-спектр вещества в ньюеле (Nujol) определяли с помощью спектрофотометра типа Parkin Elmer 421. Главные пики (за исключением ньюеля) бьти обнаружены при 3030 (цшрокий), 2730, 2620, 1620, 1590,1495, 1425, 1405, 1325, 1307, 1293, 1275, 1145,1127,895 870 см-.

Химическая структура антибиотика AT-125 в кристаллическом виде была точно установлена дифракцией рентгеновских лучей. Кристаллическому антиоиотику AT-125 можно дать химическое назваьше L-/aS, 5S/-a -амино- 3- хлор-2- {3OKca3OJUffl- 5 уксусной кислоты.

Молекулярный вес. Точное исследование рентгеновскило лучами показывало, что антибиотик AT-125 имеет структуру, соответствующую CslbCINjOs с мол. вес. 178,6.

Растворимость. Растворим в воде и легко растворим в метаноле. Сравнительно нерастворим в этилацетате, простом эфире, бензоле и хлороформе. Противомикробные свойства антибиотика AT-125.

Следующие ниже результаты получали вследстие стандартного опыта с пластинчатыми дисками, причем применяли бумажные диски (размер 13 мм) и концентрацию AT-125 1 мг/мл.

МикроорганизмЗона ингибирования

вокруг буглажных

Bacillus subtilis( 13мм)

(в синтетическом агаре)78

Bacillus subtilis

(в питательном агаре)О

Lactobacillus caseiО

Sarcina lutesО

Staphylococcus aureusО

Mycrobacterium avium0

Escherichia coli

(B питательном агаре)О

Escherichia coli(очертания не(в синтетическом агаре)36 ясны)

Salmonella schottmuelferi О

Proteus vutgarisО

Klebsiella pneumoniaeО

Saccharomyces pastorianus 53 Penicif Mum oxalicum32

Candida albicans (ишытано при 100 мкг/мл)20

Saccharomyces cerevisiae (испыхано при 100 мкг/мл) 38 5/ микроорганизм.

Лучистый гриб, используемый для получения антибиотика АТ-125, Streptomyces Sviceus. Одной из характеристик его щтамма является выделение АТ-125.

0 Пересев живого микроорганизма был депонирован в NRRL 5439. Микроорганизм изучила и охарактеризовала Alma Dietz сотрудник научно-исследовательской лаборатории Research Laboratory.

5 Описание.

Streptomyces sviceus Dietz sp.n. Цветная характеристика. При развитии на воздухе серый. Меланин-положительньш. Цветные изображения на пленках Эктахром приведены в 0 табл. 1 1.

Другие цветные характеристики приводятся в табл. 2. Культуру можно относить к серой (GY) и белой (W) цветным сериям по Треснеру и Бакусу 2.

Микроскопические характеристики. Споры

овальной до прямоугольной формы, редко украшенные выростами или короткими типами, с подсвечникообразными спорофорами. Спорофоры

0 длинные, прямые с завивающимися концами. Спорофоры можно относить к спиральной группе (S) по Придхаму и др. 3. Поверхность спор можно относить к бородавчатой группе ГЕО 11лц и Мэфьюсу 4.

Культуральные и биохимические характеристики,см. табл. З.Усвое1ше углерода Рост культуры на углеродных соединениях определяли методами по Придааму и roTjm6y 5 и Ц1ир;шнгу и Готлибу

0 6. В методах по Придхаму и Готлибу S. sviceus очень хорошо рос на основной аитатепьной среде, дульците. О-сорбите, салицине и оксалате натрия; хорошо на D-ксилозе, L-арабинозе, рамнозе, D-фруктозе, D-галактозе, D-глюкозе,

5 D-машюзе, мальтозе, сахарозе, лактозе, целлоЗиозе, рафинозе, декстрине, инулине, растворимом крахмале, глицерине, D- машште, инозите, ацетате натрия, цитрате натрия, сукцинате натрия; плохо на феноле, формате и тартрате натрия; он не растет на

0 крезоле и салицилате натрия. По методу по Ширлингу и Готлибу культура не растет на отрицательной контрольной среде (только на основной питательной среде). Он хорощо растет на положительной контрольной среде (основная питательная среда

5 плюс глюкоза). Так же хорошо или лучше, чем на контрольной среде с глюкозой, он растет на основной питательной среде плюс it -арабиноза, саха роза, D-ксилоза, инозит, D-маннит, О-фруктоза, рамноза и рафиноза. Рост на целлюлозе точно не

0 установлен.

Температура, Культура растет хорошо при 1828°С ш сахарном агаре по Беннету и Чапеку; при 18-37° С на мальтозноно-триптоновом агаре. (Она не растет при 45 и 55° С на сахарозном ага:ре по Беннету и Чапеку и на малыозно-триптоновом агаре),

Свойства относительно продуцирования антибиотика. Культура выделяет антиметаболитный антибиотик AT-125.

Источник. Почва Streptomyces sviceus - лучистый гриб с характеристиками пода, как изложено в 7.

Культура, которую изолировали из почвы, явно отличается от видов Sjreptomyces, находящихся в хранилище Vpjohn culture collection, и насколько это можно определить, от видов, отисанных в тштературе 8.

Streptomyces sviceus показьюал некоторое сходство с Streptomyces hawaiiensis 9. АТСС 122236. Обе культуры реагируют положительно ш меланин и имеют сходные свойства усвоения углерода в синтетической питательной среде по Придхаму и ГотлиЗу. Streptomyces hawaiiensis имеет открытые спиральные спорофоры, более короткие и менее выраженные, чем спорофоры новой культуры, которые длинны с завивающимися концами. Как наблюдалось в электронном микроскопе в проходящем свете, споры имеют круглую до овальной формы и покрыты тонкими шипами, что касается S. hawaiiensis и овальную до прямоугольной формы с поверхностью, редко покрытой бородавками и щипами. Отличительные характеристики S. Sviceus приведены в табл. 4.

Благодаря характерным цветным изображе1ШЯМ и микроскопическим характеристикам s. Sviceus легко отличать от характеризованных видов Streptomyces в хранилище Vpjohn culture collection и, насколько это можно определить, от культур, описанных в литературе. Культуральные характеристики, приведе1шые в таблицах, подчеркивают отличительные черты S. Sviceus. Уникальное свойство этого организма заключается в его способности выделять антибиотик AT-125. Предлагается рассматривать организм, который здесь характеризуется, как новый вид Streptomyces, называемый Streptomycas sviceus (от чешского слова svice или svicen, означающего свеча или подсвечник - спорофоры культуры подсвечникообразны Dietz, sp.n. Тип вида по зчил название разновидности Streptomyces sviceus var, sviceus в соответствии с Правилом 9d (2) Международного номенклатурного кода для бактерий ПО.

Предлагаемое соеданение получают выращиванием вырабатьшающего его организма в глубине водной питательной среды в аэробных условиях. Для получения незначительных количеств соединения можно использовать и культуры на поверхностном слое жидкости. Гриб растет в питательной среде, содержащей источник углерода и усвояемое азотистое соединение или белковое вещество. Предпочтительные источники углерода: глюкоза, неочищенный сахар, сахароза, глицерин, крахмал, кукурузньш крахмал, лактоза, декстрин, меласса и т.п. Предпочтительные источники азота - кукурузный экстракт, дрожжи, автолизированные пивоваренные дрожжи с твердыми частицами молока, соевая мука, хлопковая мука, кукурузная мука, твердые частицы молока, панкреатический перевар казеина, барда, пептонные жидкости животного происхождения, отходы мяса и костей и т.п. Целесообразно использовать углеродистые и азотистые вещества в комбинации. Так как используют водопроводную воду и добавки в неочищенном состоянии, то отпадает необходимость в добавлении мик;роэлементов, таких, как цинк, магний, марганец,

5 кобальт, железо и т.п., к ферментационной среде.

Новое соединение получают при любой температуре, пригодной для обеспечения роста гриба, например 18-40°С, предпочтительно 20-32°С. Максимум выработки соединения, как правило, достигается через приблизительно 2-10 дней. Значе-, ние рН во время ферментации обычно слабо-кислое.

В случае выращивания в больших сосудах и

5 сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную, чем спороносную форму во избежание выраженного замедления выработки нового соединения и связанного с ним неэффективного использования приборов. В связи с этим

0 желательна выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скощенном агаре. Полученный таким образом молодой, активный вегетативный ино33кулум переносится в асептических условиях в больщие сосуды или сборники. Среда,в которой вырабатьшают вегетативный инокулум, может соответствовать среде, используемой для получения

0 нового соединения, или отличаться от нее в зависимости от обеспечения хорошего роста грибка.

Антибиотик AT-125 является амфотерным соединением. Он растворим в воде и малорастворим в СНзОН.

В целях вьщеления и очистки AT-125 можно

5 пользоваться различ1Ш1ми способами, например абсорбцией с последующим вымьшанием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из раст0ворителей.

AT-125 предпочтительно рекуперируют из питательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например. 40 ф-мы Игль Пичер, Другие для этих целей пригодные сорта кизельгура5это, например, известные под торговыми названиями Super Cel (Johns manvilfs fine diatomite), Dicaiife4200 (Great Lakes, Miraflo 40 (ragle PiC herj (5,5-7,0). Конечное значение рН отчасти зависит от наличия буферов, если они вообще при0сутствуют, отчасти от начального значения рН питательной срецы, которое целесообразно установить перед стерилизацией приблизительно до 7,0.

В случае осуществления выращивания в больших сосудах и сборниках целесообразно использовать для посева скорее вегетативную форму, чем спороносную форму, во выраженного замедггения синтеза нового соединения и связанного с ним незффективного использования приборов. В связи с этим желательная выработка вегетативного инокулума в питательной бульонной культуре засевом ее аликвотным количеством почвенной культуры или культуры на скошенном агаре. Полученный таким образом молодой, активный вегетативный инокулум переносится в асептических условиях в большие сосуды или сборники. Среда, в которой вырабатьтают вегетативньш инокулум, может соответствовать среде, используемой для получения нового соединения, или отличаться от нее в зависимости от обеспечения хорошего роста грибка.

HoBbDi антибиотик AT-125 является амфотерным соединедаем. Он растворим в воде и малорастворим в СНзОН.

В целях выделения и очистки AT-125 можно пользоваться различными способами, например абсорбцией с последую1цим вымьшанием подходящим растворителем, колоночной и распределительной хроматографией, кристаллизацией из растворителей.

AT-125 предпочтительно рекуперируют из питательной среды фильтрацией через кизельгур средней пористости, например 40 ф-мы Игль Пичер. Другие пригодные для этих целей сорта кизельгураэто, например, известные под торговыми названиями Super Cel (Johns Manvills fine diatonnite, Dicalite 4200 (Great Lakes, Niraflo 40 (Eagle Richer,.

Прозрачная исчерпанная питательная среда фильтруется через хроматографическую колонку с насадкой из стиролыюй смолы с сульфокислотшлми остатками. Предпочитают водородную форму Dowex 50, в частности плотно спштый, например Dowex 50 X 16. Другими пригодными смолами являются известные под торговыми названиями Атberlite IR 12 Nalcite HCR, Chempro C-20, Permutit Q, Zeokarb 225.

После промьшки колонки антибиотик вымывается основанием, в частности NN4ОН. Содержащие-антибиотик элюаты собирают, концентрирют.

По предпочтительному способу очистки вышеописанный водный концентратп Г значени11 Д 6,2-7,8 фильтруется через колонку с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы, причем предпочитают Amberlite tR 45 (ОН. Другие пригодные смолы - это, например,АптаеП ite IR 4В, Nalcite WBR, DeAcidite Е. Duel ite А.2.

Колонку промьшают деионизированной водой, 50%-иым водным раствором МеОН и 90%-ным водным раствором МеОН, а затем вымьшают 0,1 н. уксусной кислотой в 90%-ном растворе МеОН.

Активные элюаты собирают и при уменьшенном давлении вьшаривают досуха. МеОН можно заменить На О,

Полученный остаток подвергают рашределнтельной хроматографии, предварительно растворив его в нижней фазе системы растворителей, состоящей из смеси н-бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1). Нижнюю фазу, содержащую остаток из колонки с насадкой из слабоосновной стирольнополиамидной смольг, гомогенизируют кизельгуром средней пористости, например, ф-мы Eagle Pichers FW 40, и верхней фазой системы растворителей. Полученный гомогенизированный твердый материал подают на колонку, содержащую кизельгур средней пористости и предварительно приготовленную взвешиванием кизельгура в верхней фазе описанной выше смеш растворителей, тщательно смешанной с нижней фазой, выливанием в хроматографическую колонку и, наконец, тем, что слою дают осесть, пока верхняя фаза проходит через колонку. Активные элюаты из колонки собирают, объединяют и вьшаривают досуха. Кристаллический AT-125 получают кристаллизацией подходящим растворителем, предпочтительно метанолом. Можно применять и 95%-ный этанол, водньш бутанол и воду.

Другой способ рекуперации AT-125 из фильтрованной исчерпанной ферментационной среды состоит в абсорбции на подходящей ионообменной смоле, напр. Dowex 1 (ОАС) при рН9-10 или IR 45 (ОН-) при рН 6-7. После промьшки смолы HZ О AT-125 получают вымьшанием водным и)ш метанольным NN4ОН или уксусной кислотой. Далее фильтрованную прозрачную исчерпанную ферментационную среду можно абсорбировать на угле, после чего AT-125 вымьшают соответствующей смесью растворителей, например водным ацетоном. По другому способу очистки можно хрюматографировать на силикагеле метанолом в СНС1э или CH2CI2 или смесями бензола (и;ш толуола), 95%-кого этанола и уксусной кислоты.

Титр AT-125 в исчерпанной питательной среде в отдельных стадиях рекуперации контролируют тестом с культурой Bacillus Subtil is, разведенной в чашках Петри на синтетической среде следующего состава, г:

NajHP04-7H201,7

КН2Р042,0

(NN4)2801,0

MgS040,1

Глюкоза2,0

Bacto Agar формы Difcodaboratorles Detroit, Michigan15,0

Дистиллированная вода1л

Основной расгвор с ионами металлов++1 мл

Основной раствор- с ионами металлов состоит из:

МаМо042Н2О200МКГ/МЛ

CoCljЮОмкг/мл

CuSO ЮОмкг/мл

MnS042 мг/MJi

CaClj25 Ml-/мл

FeClr4H205МГ/МЛ

ZnCl25 МГ/МГ1

ZnClj должет быть растворен отдельно с применением капли 0,1 н. HCI на 10 мл воды. Основной раствор нагревается до растворе1шя всех соединений, выдерживается сутки и фильтруется в стерильных условиях.

Эта среда засевается суспензией спор в. Subtil is (1, клеток/мл) с концентрацией 0,5мл/л. Пробы исчерпанной питательной среды наносятся на диски адсорбирующей бумаги диаметром 12,5 мм (0,08 мл/диск), диски инкубируются в течение ночи при 37° С, а затем измеряются зоны ингибирования. Соотношение между активностью пробы и диаметром зоны ингибирования вьмисляется с помощью обычных стандартных кривых.

Засеянную в. Subtil is среду можно также использовать для обнаружения антибиотика AT-125. Хроматограммы на бумаге проявляются верхней фазой смеси растворителей, состоящей из н-бутанола, метанола, бензола и воды (2:1;1:1). После проявления выс}аиивают бумагу и кладут бумажные Хроматограммы на прозрачные тарелки, содержащие засеянную среду и снимают их прилкрно через 20 мин. Тарелки инкубируют в течение ночи, как выше указано, а затем определяются зоны ингибирования.

Так как антибиотик AT-125 является амфотерным соединением, он образует соли с кислоталт, щелочными металлами (включая аммоний) щелочноземельными металлами (включая магний и алюминий) и аминами. Соли с металлами получают растворением AT-125 в воде и добавлением разбавленного основания металла до достижения значения рН раствора -8. Соли AT-125 с металлами включают соли с натрием, калием, кальцием. Аминные соли, включая соли с органическими основаниями, такими как первичнью, вторичные и третичные, моно-, да- и полиамины можно также получать, используя указанный выше или другие общеизвестные спьсобы. Далее, аммониевые соли можно получать общеизвестными способами. Другие соли получают с эффективными с терапевтической точки зрения основаниями, обусловливающими дополнительные терапевтические эффекты. К таким основаг шм относятся, например, пуриновые основания, такие как теофиллин, теобромин, кофеин или производные таких пуриновых оснований; антишстаминовые основания, способные образовать соли со слабыми кислотами; пиридиновые соединения, такие, как амид никотиновой кислоты, шдразид изокикотиновой кислоты и т.п.; фенилалкиламиены, такие, как адреналин, эфедрин и т.п.; холин и др.

Кислые соли пол чают нейтрализацией AT-125 соответствукнцей кислотой, доводи значение рН

шже 7,0, предпочтительно до 2-6. Подходящими кислотами являются хлористоводородная, серная, фосфорная, сульфаминовая, бромистоводородная и т.н. Кислые и основные cojui AT-125 можно применять для тех же самых биологических целей, что и исходное coewiHetme.

AT 125 действует на Escherichia coll и служит тя уменьшения, торможения и прекращения вьщеления слизи на цел;полозно-бумажных заводах благодаря своей противоЬактериальной активности. AT-125 можно также использовать для продления жизни культур Trichomonas foetus, Trichomonas hominis, Trichomonas Vaginalis, так как он освобождает их от Escherichia coli. Ддлее, AT-125 можно использовать в качестве фунгицида для обработки кожи для верха обуви по патенту США №3130505. Так как АТ-125 действует на Bacillus subtil is его, кроме того, можно еще ишользовать для доведения до минимума или предотвращения запаха рыбы или ящиков для рыбы, вызьшаемого этим микроорганизмом. AT-125 можно использовать также для очистки столов и оборудования в микологических лабораториях.

AT-125 действует на L1.210, вызьшаюищй в лабораториях лейкемию у мышей, и поэтому его можно ишользовать для их лечения.

Примерь А. Ферментация. Штамм Strepto.myces sviceus, NRRL 5439, из почвы используют для засева колб Эрленмейера емкостью 500 мл, содержащих 100 мл стерильной среды, сосг оящей из следующих компонентов,,г/л:

Декстроза25 г/л

Фармамедиа+ (продукт Щрмы Traders oil Mill Company,

Fort Worth Texas)25 г/л

Водопроводная водадо 1 л

До стерилизации среда, предназначенная для засева, имеет значение рН 7,2. Инокулум вьфащивают в течение 2 суток при 28° С во вращающемся встряхивателепо Гампу (250 об/мин). Инокулум, приготовленный указанным вьппе образом, применяют для засева колб Эрленмейера емкЪстью500мл, содержащих 100мл стерильной ферментационной среды, состоящей из следукнцих компонентов, г/л:

Клрбонат кальция5

Хлорид натрия2

Крахмал10

Маннит10

Фитон (папаиновый

перевар соевой муки)10

КэйСой (тонко измельченная обезжиренная соевая мука)10 Олеомаргарин из свиного

сала1 мл/100 мл

Водопроводная водадо 1 л.

Значение рН до стерилизации доводится до 7,2

при помощи 4 н. NaOH. Ферментационные колбы

засевают инокулумом в количестве 5 мл/100 мл

ферментационной среды. Ферментадионные колбы выдерживают 2-3 суток при 32° С во вращающемся встряхивателе по Гампу (250 об/мин). Максимальная выработка AT-125 в ферментационной колбе, как правило, достигается через день после начала вьщеления по каплям татра антибиошка. Приведенная ниже зависимость типична для ферментационного процесса в колбе-встряхивателе.

Время, ч. Бе/мл АТ 125

4S56

7222

9626

12016

Биоединица активности (Бе) определяется как количество антибиотика, требуемое для получения двадцатимиллиметровой зоны ингибирования диском диаметром 1,5 дюйма, обработаннь1м 0,08 мл раствора антибиотика. Тест с диском проводят, как вьпле указано.

Б. Рекуперация.

Всю исчерпанную питательную среду (250л), оставщуюся от ферментации AT-125, фильтруют, как выще указано, через кизельгур средней пористости. Образующаяся прозрачная исчерпанная питательная среда при значении рН 7-8 фильтруется «крез хроматографическую колонку с 25 л свежерегенерированного Dowex 50-16 (). Колонку промьтают 50 л деионизированной Hj О и вымывают 120 л I и. NH40H; затем собирают фракции по 6 л. Самая активная фракция (зоны ингибирования SO мм) определяется нанесением смоченных и высущенных на воздухе дисков на тарелку с Bacillus subtil is, вьфащенным в синтетической среде, как вьпие указано. Активные фракции объединяют и концентрируют при пониженном давлении в целях удаления избыткаNH40H, Определение твердого материала показьшает, что сырой водньш концентрат содержит 2950 г, а активные элюаты244г. Тверрьш материал в активных элюатах приблизительно в 13 раз активнее по отнощению к Bacillus subtilis, чем твердый материал, содержащийся в прозрачной исчертнной питательной среде.

В. Очистка.

(1) Колонкой из слабоосновной стирольнополиамидной смолы.

Активньш водный концентрированньш злюат из Dowex - 50, полученный, как вьщ1е описано, при значении рН 7-7,5 фильтруется через колонку, содержащую 4 л Amberlite IR 45(011). Колонку промьшают 8 л деионизированной Н2 О 4 л 50%-ного водного МеОН и 8 л 90%-ного водного МеОН, а затек вымьшают 0,5 н. уксусной кислотой в 90%-ном МеОН; собирают фракции по двум литрам. Самые активные фракции относительно Bacilr lus suiptilis объединяют и вьшаривают досуха при пониженном давлении; выход составляет 9,40 г остатка с активностью относительно Bacillus subtilis, превьппакнцей активность остатка описанного вьцце эяюата из Dowex - 50 в 28 раз

(2)Распределительная хроматография.

Смесь н-бутанола, бензола, метанола и деионизированной воды (2:1:1:1) перемепшвают, затем смеси дают разделиться на два слоя; слои разделяют. Кизельгур средней пористости (2340 г) взвепшвают в верхней фазе, тщательно перемепжвают с 900 мл нижней фазы, а затем выливают в хроматографическую колонку и дают слою осесть, пока вер;шяя фаза проходит через колонку. Остаток элюата из IR 45, полученного, как вышв указано, растворяют в 25 мл нижней фазы и гомогенизируют 75 г кизельгура средней пористости и 50 мл верхней фазы. Получаемый гомогенизированный твердый материал тщательно подают на колонку и начинают вымывание верхней фазой; собирают фракции по 500 мл. Самые активные относительно Вас I lus subti I is фракции выпаривают досуха при пониженном давлении, что дает 3,93 г остатка, активность которого относительно Bacillus subtilis превыщает активность описанного вьпш остатка элюата из IR 45 в 2,9 раз.

(3)Кристаллизация.

Описанный остаток, полученный распределительной хроматографией, кристаллизуют из СНзОН и перекристаллизуют из водного СНзОН 3 раза, что дает 362 мг чистого кристаллического AT- 125, активность которого относительно Bacillus subtilis превьпшет примерно в 4 раза активность высокоактивного остатка, полученного в результате описанной выше распредел1( хроматографии.

Соли антибиотика AT-125 можно получать по описанным способам. Эти соли, как указано вьппе, служат для тех же целей, что и исходный антибиотик.

Выщеизложенное изобретение было сделано в рамках контракта PH43-NC(-69-1023 с National cancer Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20014.

Цветные изображения Streptomyces svioeus на пленке

Агаровая срер

Лавандово-серая

Не растет на воздухе Светло-лавандово-серая

ТаблицаJ ктахром 11

Обратная сторона

Лицевая сторона

Коричневая Красно-коричневая Коричневая Коричневая Красно-коричневая Светло-коричневая

п

й

ТЭ О)

g

og 5fe

1 «

0)3

I.

&

я о

«

Я|

Ч-2 О I.

IS

n

О .

i|

S

U о

5

о

CN

тз л

«в -. )9Е 3CN 3

Ir 8

«

S

11

IР §

цэь

ЯГ: ни

iS i9

. «g,

.-

ч-С

СОП

(О ОС

со ОС

я X

3 S.

S

ш

и

иэ

о- (Л 0

(Л

SfS

PM04

S

°i

m 2

12

I

ч w 25 Формула изобретения 1. Способ получения антибиотика путем культивирования St reptomyces в аэробных условиях в жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, с последующим: вьщелением целевого продукта из фильтрата культуральной жидкости и очисткой, отличающийся тем, что, с целью получения антибиотика, имеющего структуру С1 N Ij.CH-CH-COJ , . используют Streptomyces sviceus. 2.Способ по п. 1,отличающийся тем, что фильтрат культуральной жидкости абсорбируют ионообменной смолой и далее злюируют целевой продукт. 3.Способ по п. 1, отличающий ся тем, что очистку целевого продукта производят путем хроматографии на колонке из слабоосновной полиаминовой смолы стирольного типа, распределительной хроматографии и кристаллизации. 4.Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве ионообменной смолы применяют смолу сульфоновой кислоты стирольного типа. 1.. А. 1954 Ann, N V Acad. Sci 60:152-154. 2.Тгэзпег, H.D and E.g. Backus 1962. Appl. Microbiol 11:335-338. 3.Pridham, T.G.C.W Hesseltine and R.G. Benedict, 1958 Appl. Microbiol 6:52-79. 4.Dietz A., and John Mathews 1970, Appt. Microbiol 21:527-533. 5.Pridham, T.G. and D. Gottlieb, 1948. g. Bacteriol 56:107:114. 6.Shirling E.B., and D. Gottlieb. 1966. Zni.j.Syr. Bacterio 16:313-340. 5 26 7.Sergeys Manuat of Determinative Bacter riology, 7-e издание (Breed Robert, S., E.G. Murray, and Nathan R Smitz 1957 Bergeys manual of determinative bacteriology, Zth Edition, the Wil.liams and Wilkins Co., Baltimore. 8.Bergeys Manual под именем Гаузе Г,Ф. Преображенская Т.П,, Кудрина Е.С., Блинов Н,О,, Рябова И„Дс и Ивешник М.А, Вопросы классификации антагонистических актиномицет. Госуд. Издательство Медацинской литературы, Москва, 1957 г, Хюггером (Hiitter, R 1967. Systematik der streptomyceter unter besonderer Berucksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika, S, Karger, Basel), Красильниковым H.A., Руководство по onрёДелению бактерий и актиномицет, Акад. Наук СССР, Москва, 1957, Ваксманом (Waksman, S.A. 1961. The actinomycetes, vol 2, Classification, identification, and descriptions of genera and spe cies. The Williams and Wilkins CO., Baltimore), и Ширлингом и Готлибом (Shirling, Е.В., and D. Gottlieb. 1968 Tnt.j.Sus.Bacteriol 18:69:189; 18:279-392; 19:391-512). 9.Cron. M.j.;, OF Whitehead, I.R. Hooper, В., Heinemann and j Lein, 1956 Antibiotics and cremotherapy 60:63:67. 10.Intern, j System Bacteriol 16:459-490. 11.. Dietz, A., Annals of the Nevy Vork Academy of Sciences, 60:152-154, 1954. 12.jacobson, E., W.C. Granville and C.E. Foss. 1948, Container Corporation of Americs, Chicago, gelinois 13.Kelly, K. L., and D.B. judd, 1955, V.S. Dept. Commerce Circ 553. 14. Tresner H.D and E.j. Backus. 1962 Appl. Michobiol. 11:335-338. 15.Pridham, T.C., et. al. 1958. Appl Michobiol 6:52-79. 16.Dietz, A. and John Mathews 1970. Appl Michobiol 21-521-533.