Способ получения антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью Советский патент 1978 года по МПК C12D9/00 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА, ОБЛАДАЮЩЕГО ПРОТИВОГРИБКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ/

Изобретение относится к микробиопогнческой промышленности, а именно к производству антибиотиков.

Предлагаемые антибиотики новые ив патентной и нау«шо-технической литера- туре не описаны.

Предлагаемый способ получения антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью, состоит в том, что штамм Asperg-ieeusrugviosu HRR 8113 выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содержащей никн углерода, азота и минеральные солВ, с последукщим выделением целевого продукта и разделением его .на компоненты.

Штамм AspergrietOb rogXjCosue NRftt48113 выделен из почвы, взятой в развалинах Помпеи, Италии, и хранится в коллекции культур исследовательской лаборатории северных районов Министерства сельскоь го хозяйства США, служба сельскохозяйственных исследований, Перрия, Иллинойс 61604 под номером NRRU 8113 и харак. теризуется следующими свойствами,

Агар Чапека. Культура рэстет медленно, достигая 1,5-2,0 см в диаметре за 15 дней при. 25°С. Поверхность колонии выпуклая и бархатистая, она сморщивает ся со временем в центре и затем cTaHOi .вится выпуклой Периферия мицелия пред- ставляет собой полосу шириной 2 мм глу боко погруженных бесцветных 1гиф и , ляется ИЗВИЛИСТОЙ. На концах воздушных гиф образуется роаоватс коричНевый эксудат. Образует бледно-пурпурный растворимый пигмент.

Через 5 дней поверхность колонии приобретает окраску от белого до желто- ватс коричнёвого цвета, обратная сторона колонии коричнево-оранжевая в цент ре и коричневатая до коричнево-пурпурной на периферии. Через 1О дней колония ум ренно желтовато-розовая. Через 14 дней колония становится светло-серо-красной, концевая поверхность становится бородав чатой и ярко-желтой. На поверхности и по концам колонии возникают беспор$ - дочно распространенные темно-желтые пучки оболочек клеток. Со временем )2

желтые бляшки и концевая поверхность становятся желтО-эелеными. Через 3 нед. наблюдается оранжево-пурпурный гон на новых поверхностных концевых компо нентах. Сначала обратная сторона колонии слегка вогнута. По мере старения холония становится плоской к поверхности агара и обратная сторона ее слегка сморшиваетси. Через 10 дней обратная сторона становится светло коричневой, через 15 пией - серовато-красной.

Коницяофоры раэбросатсы по поверхнести, иногда s виде бляшек или в пoлy. погружной полосе. Головки конидий сначала лучистые и сферические; со време нем они могут развиться в виде коротких столбиков, которые более компактны. Сферические головки диаметром мкм в среднем 50 мкм. Столбчатые головки имеют длину до 140 мкм, ширину 70 мкм

Конидии сферические до полусферичес- ких, мелкоскладчатые, зеленовато-золотиртые в массе. Их диаметр 2,8-3,9 мкм, в среднем 3,2 мкм. Стеригмы бесцветные /1яина первичных стеригм составляет 4,7-11,0 мкм, в среднем 7,9 мкм, Е наиболее широкой точке они имеют 2,4 Мк ;и сужаются до 1,6 мкм.

Вторичные стеригмы могут возникать одинарными или парными, они получаются из первичных, имеют плоскую форму. В наиболее широком месте имеют разме ры 3,0 мкм и сужаются до О,4 мкм, где они становятся трубчать1ми. Трубчй тый кончик имеет длину 1,2 мкм. Общая длина составляет 5,5-12,6 мкм, в cpefl-i нем 9,2 мкм.

Везикулы сферические до полусфер ческкх, они могут быть апикально плоскими, становясь со временем коричневыми. Их диаметр 7,4-11,2 мкм; в среднем 9,4 мкм.

Коннднофоры гладкие, сравнительно толстостенные, вначале они гиалиноиле, aateM переходят в светло-коричневые. Они слегка шире в везикуле и могут слег кв сходиться на конус близ стожки клет кн. Средняя ширина 5,9 мкм. Котшдисфо ры имеют длину 47,7-166,6 мкм, вереднем 1О6 мкм. Они возникают из погружных гвЕф или горизонтально из воздушных

гнфовых нитей.

Аскогвннов состояние наблюдается через 20 дней. Р1ебольшае желтоватые пучкн оболочвк клеток, возникакяцие на поверхности, можно найти на любом ypodне мипелия. Они состоят из оболочек клеток, внутри которых находится ошш или несколько клейстотениеа. Оболочка клеток шаровидные, полуитаровидные.

154

овалып51е или удлиненные, они толстостев Hfjie и гиалитювые. Диаметр шаровидных оболочек клеток составляет 18-24 мкм, в среднем 21,8 мкм.

Клейстотеции шаровидные до полушаровидных, толстостенные ср)авнительно вязкие и волокнистые. Вначале сравнительно бесцветные, они становятся красно-пурпур1Пз1МИ и темнеют со временем.

Их диаметр 165-470 мкм, в среднем 275 мкм.

Агар с солодовым экстрактом. Колони растут при 25 С, быстро расширяются, достигая 4-5 см за дней. Сначала серо-белые, колонии ;становятся умеренно оливково-зелеными через 4 дня. Небольшие жел товатые пуч:ки оболочед клеток расположены пунктиром по краю и беспорядочно разбросаны по фётроподобной поверхности агара. Через 20 дней эти пучки оболочек клеток покрыва5от коркой большую часть поверхности. Обратная сторона колонии серовато-желтая. Через 15 дней образуется аскогенное состояние Небольшие желтоватые пучки оболочек клеток, образующиеся на поверхности, можно обнаружить на любом уровне в мицелии.. Они состоят не оболочек клеток, внутри которых находится одна или несколько клейстотециев. Обопочкя клеток могут покрывать кОркой большие пло щадн над головками конидий. Оболочки клеток шаровидные или полушаровидные, овальные или удлиненные толстостенные щ гиалиновые. Диаметр шаровидных оборочек клеток составляет 18-24 мкм, в среднем 21,8 мкм.

Клейстотеции шаровидные или полуша ровидные, они окрашены в темно-краснокоричневый цвет. Диаметр 389-700 мкм в среднем 506 мкм.

Леки хрупкие, гиалиновые, полушаровидные до овальных. Диаметр полушароБидных аск составляет 8,7-11,9 мкм, в среднем Ю, 3 мкм. Размер овальных зек 10,,2x8,7 - 10,3 мкм, в среднем 12,2X9,1 MKMi

Аскоспоры красно-оранжевые, мелкоскладчатые с двумя параллельными товкосплете1Пш1мн экваториальными гребешками, ширина которьгх до 0,8 мкм. i Аскоспоры выглядят двошсовыпуклыми по продольной оси. Если гребешок периферийный, то аскоспоры шаровидные. Диаметр шара 4,9-6,3 мкм, в среднем 5,4 мкм.

Указанный штамм можно вырашивать на питательных средах, содержащих ноточники углерода, няпример глюкозу, мелассу, крахмал, лактозу, сахарозу, мальтозу, глицерин, ИСТОЧНИКИ ааюта, наирвймер, экзиматический гидролизат казеина пе-птон, глутамат, минеральные соли и микроэлеме-нты. Для продуцирования значительных количеств смеси, антибиотика А-30912 предпочитают вести погружную аэробную ферментадшо в ферментерах. Неболь шие количества смеси антнбиогикаА 30912 можно с помощью встряхиваемой в кол.бе культуры. ВследCTBi;e большого интервала времени при продуцировании антибиотика, обычно свй занного с инокулированием крупных резе вуаров споровыми формами мякроорганиэ мов, предпочтительно применять вегетативт ый инокулум. Вегетативный инокуяум . приготовляют инокулированием небольшог объема культуры споровыми формами или мицелиальными част1вдамн микроорганизма и получают активно растущую куль туру микроорганизма. Затем вегетативны инокулум переносят в резервуар. Среда, применяемая для вырашивания вегетативного инокулума, может быть такой же, как и для крупных ферментации, но можно применять и другие среды. Продугрру щий антибиотик А-309.12 микроорганизм можно выращивать при 2О-43°С, микро организм хорошо размножается при 25ЗО С. Оптимальное продуцирование антибиотика А-30912 происходит пра 23 С. Через ферментационную среду продувают стерильный воздух. Для аффективного продуцирования антибиотика объем воздуха при продуцировании в резервуара составляет около 0,4 объема воздуха на 1 объем культуральной среды в минуту. Продуцирование антибиотика А 30912 контролируют во время ферментации отбором проб спиртоиз1х экстрактов культуральной жидкости на антибиотическое действие против микроорганизма, чувст вительного к антибиотику А-ЗО912, например Candida абЪтсапэ.Биоанализ ведут с помощью бумажных дисков на посеянных агаровых пластинках. Как правило, антибиотическая активность обнару кивается уже на второй день ферментации. Макс мальное продуцирование антибиотической активности , обычно достигается между третьим и шестым днями. Пример, Готовят культуру Aspet g-i e.U5 rugu o5UfiNRRb 8113 и хранят ее на скошенном агаре 18У150 мл, еледующего состава, %: Декстрин1,ОООО Энзиматический гидролйзат казенна 0,2000 о.юоо Экстракт дрожжей 0,1000 Экстракт ГОВЯДШ1Ы 0,02ОО М -ЗО -ТНзО 0,0200 0,0004 98,5596 Инокулированную вегетационную среду инкубируют в широкогорлой колбе Эрленмейера на 25О мл при 25 G в течение 24 ч на качалке (250 об/мин). Эту инкубированную вегетационную среду можно применять прямо для инокулирования вегетационной среды из второй стадия. Лучше ее хранить для последующего нопользования путем сохранения культуры в паровой фазе жидкого азота. Культуру готовят для такого хранения в нескольких небольших пуаырьках следующим образом; в каждый пузьфек помешают по 2 мл инкубированной вегетационной среды и 2 мл раствора глицерин-лактоза следующего состава, %: Глицерин2О Лактоза1О Деионизированная вода7О Полученные суспензии хранят в паровой фазе жидкого азота. Суспензию (l мл) применяют для инокулирования 5 О мл ферментационной среды из первой стадии, состав которой такой же, как для эанев описанной ферментационной среды/ Инокулированную среду из первой стадии инкубируют в широкогорлой колбе ЭрленмвЙе- ра на 250 мл при 25 С в течение 22 ч на качалке (25О об/мин). Для получения большего объема иноку дума 10 мл описанной ферментационной среды первой стадии применяют для инокулирования 4ОО мл ферментационной среды второй стадии такого же состава, как и среда первой стадии. Срессу второй стадии инкубируют в .широкогорлой колбе Эрленмейера на 2 л при 25 С в течение 25 ч на качалке (250 об/мин). Инкубированную ферментационную второй стадии (8ОО мл)/получвнную, как указано выше, используют для ино кулирования 1ОО л стерильной ферме тационной среды следующего coctaaa, г/л: Глюкоза25. Крахмал10 Пептон.1О Черная патока5 Энзиматвческий гидролиэат казеина 4

,0

ксе0,5

СхаСО,2,О

FeSQ lHjO ,

(растворенное в .

2 мл концентрированной нее )О,О04

Деионвзированйая

вода до, л1,0 ,

После стерилваапнн в автоклаве при 121 С в течение 3.0 мин при давлении 1,,1 атм рН среды 6,8. Инокулированную среду ферментируют в фермента торе емкостью 1ё5 л при 25 С в течеч ние 4 дней. Ферментапвонную среду продувают стерильным воздухом при расходе 0,5 обьем/обьем/мин.1. Ферментационную среду перемешивают обычной мешалкой при ЗОО об/мин.

2ОО л культураоьной жидкости тщательно перемешивают с 200 п метанола в течение 1 ч, затем отфйльтровь1вают на фильтре из диатомовой земли рН филы рата доводят до 4 с .помощью 5н.НС. Подкисленный фильтрат экстрагируют дважды равными Объемами хлороформа. ХлорЬформен11ые экстракты соединяют вместе и упаривают в вакууме до объема около 4 л. Этот концентрат добавляют к 60 л диэтйлового эфира для осаждения смеси А-ЗО912. Осадок отделяют фильтрованием, его высушивают и получают 38 г смеси антибиотика А-ЗО912 в виде серого порошка. Фильтрат упаривают в вакууме и получают масло; это масло растворяют в 50О мл метанола. Метанольный раствор добавляют к диэтиловому эфиру (7,5 л) для осаждения дополнительного количества антибиотика А-ЗО912. Осадок также отделяют фильтрованием, сушат и получают еще 3,5 г антибиотика А-30912

П р и м е р 2. Выделение компонента А антибиотика А-ЗО912.

Комплекс антибиотика А-30912 (20 г вводят в силикагелевую колонку (4X107 с в смеси ацетонитрил вода (95:5). Колонку элюируют смесью ацетонитрил-вода (95:5) при расходе 1-2 мл/мин/собирают фракции объемом около 2 О мл. Эти фра.&1ШН проверяют тонкослойной силикагелейой хроматографией, применяя смесь ацетонио рил-вода (95:5) и биоотметку Candidcuae bicc ns . Фракции с 74 по 125 соединяют вместе и упаривают. Концентрированный раствор кристаллизуют и получают 124 мг стеригматоцистина. Фракции с

212 по 273 соединяют вместе и упаривают Б вакууме, получают масло. Это маоло растворяют в небольшом объеме метанола. Метанольный раствор добавляют к

диэтиловому эфиру (l5 объемов). Образовавшийся осадок отделяют и сушат, получают 23 мг компонента Д антибиотика А-30912. Фракции с 274 по 473 содержат компоненты А, В С и Д антибиотика А-30912. Фракции с 482 по 900 содержат компоненты А, Е, F и G антибиотика А-ЗО9.12, Фракции с 438 по 481 объединяют и упаривают в вакууме, получают масло. Это масло растворяют в небольшом объеме метанола, метанольный раствор добавляют к диэтиловому эфиру (15 объемов). Образовавшийся осадок отделяют и сушат, получают 2,17 г кок Чонента А антибиотика А-30912.

Частично очищенный антибиотик А-30912, содержащий компоненты В, С и Д антибиотика А-30912 (75О мг) из фракций 274-437 хромагографируют на сшшкагелевой колонке (2,2X51 см), собирают фракции объемом около 1 мл и элюируют следующими растворителями:

Фракции:

1-25 Ацетонитрил

26-62Ацетонитрил 1% воды

63-700 Ацетонитрил + 1,5% воды.

фракции из колонки контролируют силекагеле вой тонкослойной хроматографией, применяя смеси ацетонитрил-вода (95:5) и бензол-метанол (7:3) и биоотметкуСопdido aeticans . фракпии 535-685, в которых содержится компонент Д антибиотика А-ЗО912, объединяют, выпаривают в вакууме до- масла. Это масло растворяют в небольшом объеме метанола и добавляют к диэтиловому эфиру (l5 объемов Образовавшийся осадок отделяют фильтрованием, сушат и получают 69 мг компонента Д антибиотика А-30912.

Частично очищенный комплекс антибиотика А-ЗО912 (18 г), содержащий компоненты А, В, С и Д А-30912 и фракций 212-437, растворяют в минимальном объеме смеси ацетонитрил-вода (4:l) и хроматографируют на колонке с окисью алюминия (з,8Х56 см)#собирают фракции объемом около 2О мл. Колонку элюируют следующими растворителями:

Фракции:

1-300 Ацетонитрил-вода (4:1)

301-509 Ацетонитрил-вода (7:3),

f

Фракции из колонки проверяют силик гелевой тонкослойной хроматографией, как описано выше. На основе этих данных фракции объединяют и упари15ают до aoла, масляные остатки растпоряют в не- большом количестве метанола, метанольные pacTBOpj осаждают 1О-15 объема- ми диэтилового эфира. Способ соединения

Для получения очищенного комплекса С часть фракций 6-28 (2 г) растворяют в метаноле, сорбируют на достаточном количестве силикагеля, сушат и вводят в верхнюю часть силикагелевой колонки (1,9X80 см), заполненной ацетонитрилом Колонку элюируют ацетонитрилом, подаваемым .с расходом 2 мл/мин, собирают фракции объемом около 10 мл. На фрак;ции 117 растворитель меняют на смесь

Компонент А антибиотика А-30912, обла1даюший противогрибковой активностью, имеет:

Эмпирическую формулу Cy.5,H,,.. Элементарный состав, %:

С 56,52

Н7,29

N8.68

о 27,09

Молекулярный вес 1100. Cotl -44° ГС 0.5;СН50Н)

id.lll- -ise (с о,5:СНзОн)

Мгиссимальные частоты поглощения в ультрафиолетовом спектре (в кислом и нейт1зальном метаноле) 225, 275, 284 нм в (Х.-НОПНОМ метаноле 245 и 290 нм.

аиетонитрил-вода (99:l). Фракции из копонки контролируют тонкослойной хроматографией. На основе данных тонкослойной хроматография фракции объединяют, выпаривают до маслянистого остатка, маслянистые остатки растворяют в небольшом объеме метанола, метанольные раст-

воры осаждают 1О-15 объемами диэти- лового эфира. Содержание компонентов и вес фракций приводятся в табл. 2.

Таблида2

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре ( КВг ):

2,97 (сильный), 3,39 (средний), 3, 47 (слабый), 5,99 :(сильный),6,10 (сильный), 6,49 (средний), 6,56 (средний), 6,9О (средний), 8,00 (слабый), 9,13 (слабый/, 11,77 (слабый) мкм.

Максимальные частоты колебаний при ядерномагнитном резонансе (в пердейтерометаноле):

( 176,1, 174,3, 173,4, 172,7 169,8 158,4, 132,8, 130,9,129,6, 129,0, 116,2, 77,0. 74,4, 75,7, 71,3, 70.9,69,6, 68,,4, 68,7. 56,9. 56,1,52,9, 39,0, 38,5, 36,8, 35,2, 33.9, 32,9, 32.6,30,7, 30,4,30.2, 2,2 фракций, вес полученного вешества и содержание компонента в соешгаенных фракциях приведены в табл. 1. Таблица

27,0, 26,5, 23,6, 20,1/19,6, 14,-1 и 11,3 ч/млн.

Титруемую группу с вепгпшиой р Ка 312,8 (начальное рН 6,9) в в6%р-ном В0ДНОМ растворе димегилформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в полярных органических растворителях, например метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетатв не растворимо в неполярных органических растворителях, например дйэтиловом и петролейном эфирах.

Компонент Д антибиотика А-30912, обладакишй противогрибковой активностью имеет:

ЭлeмeнтapVIЫй состав, %:

, С 56,37 Н 8,17

N 8,54 , ,:

О 26,92

Молекулярный вес .

oLjy 0° (С 0,34; ).

Мавх:имальт1ые частоты поглощения в ультрафиолетовом спектре ( в кислом и нейтральном метаноле) 225 и 275 нм, в основном 240 н 290 нм.

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре ( ):

2,98 (сильный), 3,31 (слабый), 3,3 (плечо), 3,40 (средний)|;,3,48 (слабый), 5,76 (слабый), 6,01 Гсильный), 6,10 (плечод 6,49 (средгшй), 8,57 (средний), 6,90 .(средний)7,81 (сда6ый).8,07 (слабый), 9,16 (слабый).

Белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетате, в вод ном растворе, особенно с рН больше 7,0| не растворимо в диэтиловом ире и петролейном эфире.

Компонент В антибиотика А 30912 имеет:

Элементарный состав, %: С 57,36 И 5,92

N 8,75

О 26Л..

-170 (с 0,5| CHjOH) .

47 (С 0,5; СНзОН)

Максимальные частоты поглощения в уиьтрафнодетовом спектре (кислом и нейтральном метаноле) 223 и 278 нм, в ooiноваом 242 и 292 нм.

Максимальные частоты поглощения в ш-тфракрасном спектре (КВг); 2,99, 3,49 6,09, 6,15, 6Д5, 6,54; 6,61, 6,94, 7,62, 8,07,-.9,26 и 9,39 мкм.

Титруемую группу с величиной pKoi 13,0 (начальный рН 7,9l) в 66%-ном водном растворе диметипформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформаМИДе, диметилсульфоксиде, этилацетате и в растворах с рН выше 7,0; не растворимо в оиэтиловом и петролейном эфирах.

Компонент С антибиотика. А-ЗО912, имеет;

. Элементарный состав, %: С 56,76 Н7,88

М 10,61 О 25,09 сЛЗ| „33 (Со,5;СМэОН).

с13 lie ( С 0,5 CHgOH)

Максималь.ные частоты поглощения б ульт1зафиолетовом спектре ( в кислом и нейтральном метаноле) 223 и 275 нм, в оснбвном 240 к 290 нм.

Максимальные частоты поглощения в инфракрасном спектре (КВг) 2,98, 3,ЗО 3,43, 3,51, 6,01, 6,12, 6,47, 6,90, ;7,04, 7,22, 7,38,8,00, 8,30 и 9,13 мк

Титруемую группу с величиной рКа 13,08 (начальный рН 7,9з) в 66%-ном водном растворе дйметилформамида.

Белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, дйметилформамиде днметклсульфоксиде, этг-шацетате, и в водных растворах с рН выше.7,0; не растворимо в Диэтиловом я петролейном эфи- pax.

Отделы1Ыв компоненты смеси антибиотиков А 30912 разделяют и идентифицируют с помощью тонкослойной хроматографии. Лучщим Ьорбентом является сйлшсагель; бензол-метанол (7 ; 3 по рбьему/ является лучшим растворителем.

Величины компонентов антнбиогика А-30912 с применением .тонкослойной . хроматографии на силидагеле со смесыо растворителей бензс№ метанал (7;3) , бномет.яшнм мшфооргатшзмом CbtididQkC№ taiecirts приведены в табл. 3.

Компбнент комплекса Аг30912

А

В С

д

Компоненты А и Д антибиотика А-ЗО912 15 обладают противогрибковой активнсютью.

Эту активность измеряют с помошыо обычной: диск-диффу жонной методики (тампоны 6 мм погружают в растворы, содержащие антибиотики, тампоны помещают на 20

Candida aetoicohs

T icfiopb(ton mentoig-rophsiteft

Компонент А антибиотика А-ЗО912 против дермато ятов

rpiciiophvton mentoi fophsrtes Tpicbopb ton g aCtinoie Trictiophvton meg--inihi Tr ic1ioph)ton auinci eanum Tfictiopti ton hubrum Trichop1i ton sctioenceinii Trichop-h ton te e%tre Tfichophvton tonsuroin Лicpo5po ium orvDseum

ТаблицаЗ

R.

О,35 0,45 0,54 0,59

агаровые пластины, засе5шные испытуе мым организмом). В табл. 4 и 5 приведена минимальная ингибиругошая концент рация (мик) на диск, при которой антибиотик А-30912 иншбирует перечислев,ные микроорганизмы.

Таблица 4

0,5

O,625 0,07 0,07 8

Т a б л и ц a 5

1,25-0,039

1,25 0,0195

1,25

O,OQ98 0,0195 0,O195

1,25-O,156 O,156-O,O38