Способ усиления роста нежвачных животных Советский патент 1980 года по МПК A23K1/17 

И было установлено, что он принадлежит к классу антиномицетов, дающих спорангий, подобный спорангию вида Act I noptanes . Поэ.тому для роста поль зовались различными средствами, применявшимися при выращивании этих видов. Суспензии культуЕ« готовили путем дробления кусков культуры, сня той с пластинок с агар-агаром. Эти суспензии употребляли для выращивания культуры в пробирках, на пластинках или в чашках Петри, на различны средах. Температура инкубации соста ляла 28С. Результаты опытов фиксир вали через интервалы вплоть до 22 дней при некоторых опытах, но больши ство результатов регистрировали чере 14 дней. Окраска культуры оценивала по Мэрцу и Паулю (Словарь окрасок 2-ое издание, 1950 ). Эта новая куль тура (Пфиз&р Г.. 24090) была доставлена в Аме риканскую Коллекцию Типов Культур в Роквилле, Мэриленд, 11 мар та 1974 и получила название nes aurauticolor АТСС 31011. Среды для итендификации, применяв шиеся для охарактеризования культуры И ссылки на их состав, приведены ниже; 2%-ный агар-агар на водопроводной воде Картофельно-морковный агар-агар (следует использовать только 30 г картофеля и 2,5 г моркови на 20 г агар-агара) Сахарный агар-агар Чапека Глюкозно-аспарагиновый агар-агар Агар-агар с экстрактом дрожжей и солодом Агар-агар Хики и Треснера Картофельно-глюкозный агар-агар Крахмальный агар-агар Желатина Тирозиновый агар-агар Железо-пептоновый агар-агар Дифко Снятое молоко Дифко Декстрозно-нитратный бульон Среды № 1 с 3,0 г глюкозы вместо сахарозы и без агар-агара Бульон на основе органического соединения и нитрата Среда АТСС 172 Использование углерода. Агар-агар на водопроводной воде: рост слабый, колонии толкие, плоские примерно 9D2 (очень слабо-розовые); воздушный мицеллий отсутствует,субст рат : мицеллия от бесцветного до 902; растворимый пигмент отсутствует Сахарозный агар-агар Чапека: рос от умеренного до хорошего, колонии плоские, .примерно 9.6.1 (светло-оран. жевые) ; воздушный мицеллий отсут.ствует субстрат мицелЛия около 9G6; растворимый пигмент отсутствует. Глюкозно-аспарагиновый агар-агар рост ; умеренный,колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно 9L9 (светл оранжевые); воздушный мицеллий отсутствует, растворимый пигмент отсутствует. Агар-агар с экстрактом дрожжей И солодом: роста-не наблюдается. Агар-агар Хики и Треснера: рост от умеренного до хорошего, колонии слегка возвышаются и шероховаты, примерно 9F9 (мутно-оранжевые); слабый беловатый налет на поверхности: субстрат- мицеллия примерно 918, бледно-коричневатый растворимый пигмент. Картофельно-глюкозный агар-агар : рост умеренный, колонии возвышающиеся, шероховатые, примерно9L9 (светлооранжевые), воздушный мицеллий отсутствует: субстрат мицеллия примерно .9L9; растворимый пигмент отсутствует. Тирозиновый агар-агар: рост от слабого до умеренного, колонии плоск.ие, примерно 13А10 (мутный красноватооранжевый цвет) ;воздушный мицеллий отсутствует, субстрат мицеллия примерно 10D11; коричневый растворимый пигмент, о Желатина: рост умеренный, колонии плоские, примерно 9К12 (красноватооранжевые) , следы беловатого налета, субстрат мицеллия примерно 9К12; растворимый пигмент отсутствует. Крахмальный агар-агар: рост от умеренного до хорошего, колонии возвышающиеся, примерно 9К10 (оранжевые), слабый,беловатый налет, субстрат мицеллия примерно 9,К10; светложелтый растворимый пигмент. Крахмал подвергается слабому гидролизу; степень сжижения желатины высокая, нитраты не восстанавливались до нитритов, в любой среде, содержащей нитраты, даже за 22 дня (рост бвш очень слабым в декстрозно-нитратном бульоне, но хорошим в бульоне, содержащем органические вещества и нитрат) ; образование сероводорода - незначительное j в железо-пептоновом агар-агаре образования растворимого пигмента не наблюдалось; в молоке не наблюдалось коагуляции или гидролиза даже через 2 дня; тирозин не дигерировался; рост в среде АТСС 172 наблюдался при 21-37 с, при наилучшем росте при 28-37 с; при температуре роста не наблюдалось. Арабиноза, фруктоза, глюкйза, маннит, раффиноза, рамноза, сахарозй и ксилоза потреблялись; инозит не потреблялся. Ни для какой из сред не наблюдалось запаха. Спорангий образовывался лишь на картофельно-морковном агар-агаре. При этом образовывался палисадный слой. Измерения указали на 5,5-11x4,5-8 мкм по ширине и широте и 9-12 мкм по высоте. Колонии были многочисленными, неправильными по форме и выбрасывали споры при постепенном размягчении. Спорангий на картофельно-морковном агар-агаре по прошествии трех недель инкубации вьи1елял споры за несколько

часов при температуре около 21°С, если куски колоний погружали в небольшое количество раствора 1 г глюкозы и 1 мл твина 80 в 1 л воды.

Споры образовывали цепочки неправильной формы в спорангии, но, будуч освобожденными от спорангия, становились субглобозными и имели ширину от 1,6 мкм до эллиптической широкой 1,6-2,2x1,1 - 1,6 мкм. Почти все они были подвижными.

Попытка идентификации привела к сравнению этой культуры с А. aurautlcolor АТСС 15330. Новые штаммы А. aurauticoHor АТСС 31011 и A.auraiiticofor АТСС 15330 выглядели по существу сходными с морфологической точки зрения, окраски и растворимого пигмента на агар-агаре Беннета, питателном агар-агаре, агар-агаре с экстрактом дрожжей, глюкозно-аспарагиновом агар-агаре, глицерино-аспарагиновом агар-агаре, агар-агаре с яблочно-кис.лым кальцием и агар-агаре с тирозино

Ни одна культура не восстанавливала нитратов до нитритов; обе они образовывали небольшое количество сероводорода и не образовывали меламин на железо-пептоновом агар-агаре, обэ они вызывали гидролиз крахмала. A.aurautiсоЕог АТСС 15330 не вызывал изменений снятого молока в пробирках, в то время, как новая культура вызывала осветление трех из шести пробирок с молоком и по прошествии 21 дня образовывался желто-кремовый пигмент.

A.aurautiсоЕог АТСС 31011 потреблял глюкозу, арабинозу, фруктозу, маннит, раффинозу, рамнозу, сахарозу и ксилозу. А.аи гаиtiсо ог АТСС 15330 потреблял все эти сахара, за исключением раффинозы. Спорангий и споры двух культур были сходными причем споры А.аиraut1соБог 15330 были более сходными со стерженьками

A.aurautiсо2ог АТСС 1ВЗЗО не проявлял какой-либо бактерицидной активности, в условиях ферментации. A.aurautiсоЕог АТСС 31011 образовывал смесь антибиотиков, охватываемую изобретением.

Культивирование А,аи гаиtiсо 1 or АТСС 31011 предпочтительно происходит в водной питательной среде при 28-36°С в погруженном, аэробном состоянии, при перемешивании. К числу питательных сред, полезных для этих целей, относятся те, в которые включаются источник усваиваемого углерода, такие как сахароза, крахмал, и мелассы; источник органически связанного азота, такие, как казеин, продукт энзиматического дигерирования казеина, соевая мука, мука из семян хлопчатника, мука из арахиса и глютен пшеницы. Источниками роста могут также явиться отходы винокуренных заводов, рыбья мука и экстракт дрожей, а также соли такие, как хлористый натрий и карбонат кгшьция и следовые неорганические вещества, такие как железо, магний, цинк, кобальт и марганец, которые также дают хорошие результаты. Если во время ферментации происходит чрезмерное пенообразованне, то можно вводить такие антипенообразователи, как растительные масла или силиконы, добавляемые к . питательной среде. Аэрация среды в резервуарах при вырасщвании культур, в погруженном состоянии .предпочтительно проводится со скоростью

около 1/2-2 объема свободного воздуха на объем бульона в минуту. Скорость перемешивания поддерживается при помощи мешалок, обычно сходных с теми, которые употребляют в бродильной промьпиленностй. Само собой разумеется, что следует поддерживать асептические условия во время переносов организма и в течение всего его роста.

Агент инокулирования для приготовления смеси антибиотиков может быть получен путем использования культуры с пластинки культуры на среде, например, АТСС 172.

В колбах при перемешивании рост обычно достигает своего максимума по прошествии примерно 4 дней, в то время как при инокулировании в резервуарах наиболее благоприятным

периодом является период от 2 до 3 дней. Значительная бактерицидная активность достигается на конечной стадии ферментации примерно за 20-30 час.

Способ производства антибиотиков во время процесса ферментации обычно контролируется биологическими проверками бульона в применении чувствительного штамма StaphyEococcus

aureus. При этом применяется стандартный метод испытаний на пластинке, при котором зона ингибирования, окружающая кружок фильтровальной бумаги, насьпценной бульоном, принимается за меру бактерицидной активности. После того, как бактерицидная активность сбраживаемого бульона достигла желаемого уровня, продукты вы,целяют либо из всего бульона, Либо из профильтрованного бульона.

В последнем случае мицелий удаляют путем отфильтровывания или центрифугирования. Можно пользоваться оборудованием различного типа, например, фильтр-прессы, центрифуги и т.д.

Полезным способом является метод тонкослойной хроматографии на силикагеле; этот метод служит для анализа смеси антибиотиков, полученных в ферментационной среде, и дает возможность установить состав сырых и очищенных материалов, вьщеленных экстрак цией из сбраживавшихся бульонов. Разделение компонентов смеси антибиотиков-, само собой разумеется, зависит от содержания антибиотиков в системе Слишком малая бактерицидная активност не дает возможности обнаружить те .компоненты антибиотика, которые присутствуют в малых количествах; слишком высокая бактерицидная активность приводит к эффекту сопротивления с вытекающим из этого неудовлетворительным разделением. Система проявителей при тонкослойной хроматографии представляет собой смесь хлороформа с этанолом (9:1). Тонкослойные хрЪматограммы: после проявления могут осматриваться в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 и 366 ммк.Биоавтографическое обнаружение бактерицидных компонентов может быть осуществлено путем наложения товкослойной хроматограммы на агар-агар с питательными вещес вами, в который внесены зародыши чувствительного штамма А taphy liococcus aureusi или другого чувствительного организма. К числу главных компонентов смеси антибиотиков, выделяемой A.aurauticofor АТСС 31011, относится ряд макр циклических лактонов и депсипептидны бактерицидных компонентов. Появление или непоявление или процентный соста смеси этих антибиотиков меняется от ферментации кферментации и является функцией времени,, величины рН, соста ва среды и т.д. При наборе условий приведенных в примерах, главными бак терицидными компонентами смеси анти,биотиков являются Соединения 31211, (депсипептид) и 39926(макроциклический лактон), в то время, как к числу бактерицидных компонентов, при сутствующих в незначительном количес ве, относятся Соединения 37932 (депс пептид) и 35763 (макроциклический лактон) .. Компоненты смеси антибиотиков могут быть разделены и выделены из ферментационного бульона при применении самых различных способов, вклю чающих экстракцию растворителей, про тивоточное распределение по Крэгу, колоночную хроматографию или комбина цию этюс способов. .При экстрации антибиотиков из бульона можно пользоваться различными органическими растворителями, такими как хлороформ этилацетат и метилизобутилкетон. Экстракцию растворителей предпочтительно проводят путем двукратной экстракции бульона при величине рН 7 при помощи объема растворителя, примерно равного 1/3-1/2 объема бульона, из которого желательно выделить смесь антибиотиков. В зааисимости от применяемого объема бульона пользуются различным оборудованием, таким как делительные воронки, резервуары с мешалками и механическим Оборудованием для экстракции, например, центрифужные сепараторы, которые дают возможность осуществить процесс экстракции. Рекомендуемый метод выделения и рекуперации компонентов смеси антибиотиков заключается в следующем: либо не осветленный, либо осветленный бульон доводят до величины рН около 7 и экстрагируют двумя порциями метилизобутилкетона, объем которых составляет от примерно 1/3 до 1/2 объема экстрагируемого бульона. Экстракт в растворителе концентрируют в вакууме и концентрант обезжиривают путем экстракции его гептаном или петролейным эфиром. После этого обезжиренный экстракт в растворителе выпаривают досуха в вакууме.Твердые вещества подвергают противопоточному распределению по Крэгу (6 тарелок) C;j использованием 5 ч. толуола, 2 ч. этанола, 3 ч. водного фосфатного буферного раствора с рН 4,5. Разделившиеся слои образуют верхнюю и нижнюю фазы систеглы противоточного распределения. После распределения слои анализируют методом тонкослойной хроматографии. Разделенные фракции выпаривают досуха в вакууме. Твердые вещества, содержащие депсипептиды, растворяют в хлороформе, обрабатывают активированным древесным углем, фильтруют и выпаривают в вакууме. Остаток, полученный после выпаривания хлороформа, растворяют в ацетоне. Твердые вещества, осадившиеся при прибавлении гептана, растворяют в небольшом количестве хлороформа и вносят в колонку силикагеля, забуференного до рН 6, изготовленную в присутствии хлороформа и н-пропанола, в соотношении 99:1 об/об. Колонку проявляют той же системой растворителей под давлением 5600 н/м. Отдельные участки колонки контролируют методом тонкослойной хроматографии. Фракхдаи, содержащие разделенные депсипептиды, объединяют, выпаривают в вакууме и содержимое их кристаллизуют из ацетона-гепатана. Фракции, полученные противоточным Методом,содержащие макроциклические лактоны, объединяют, выпаривают в вакууме и твердые вещества растворяют в этилацетате. Раствор перемешивают с силикагелем, фильтруют и растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в этилацетате и производят осаждение гексаном. Твердые вещества разделяют в небольшом количестве хлороформа и хроматографируют под давлением 5600 н/м- на колонке силикагеля, забуференной до рН 6,0 и изготовленной в присутствии этилацетата. Для проявления пользуются системой из этилацетата тетрагидрофурана и гексана в соотношении 80:20:20. Учас ки колонки контролируют методом TOEIK слойной хроматографии, фракции, соде жащие разделенные макроциклические лактоны, объединяют и выпаривают в вакууме. Отдельные фракции обрабатывают дополнительным противоточным распределением по Крэгу и/или колоночной хроматографией с использовани ем различных -систем проявителей.Тщательное контролирование каждой стади очистки дает возможность выделить ин дивидуальные макроциклические лактон в достаточно чистом состоянии, так что фракции в растворителе могут быт выпарены досуха с получением чистых компонентов. А. aurauticoEor АТСС 31011 по мен шей мере четыре депсипептида и по меньшей мере четыре макроциклических лактона. Однако, первичными компонентами являются депсипептиды. Сое динения 37 277 (основные) и 37 932 (побочные) и макроциклические лактон Соединения 36 926 (основные) и 35 76 (побочные). Сырые смеси антибиотиков, получае мые непосредственно из бульонами очи щенные индивидуальные компоненты обладают широким спектром бактерицид ных свойств. Максимальная синергетическая активность у комбинаций очищенных макр циклических лактонов и депсипептидов была достигнута при интервале соотно шений 1-2:1, Примерно такие же соотношения наблюдаются дпя ферментацион ных бульонов А. aurauticoEor АТСС 31011 и для выделенных из них сырых смесей антибиотиков. Это открытие является противоположным тому, что наблюдается для других синергетических смесей антибиотиков, для которых синергетические факторы наблюдаются у ферментационных бульонов и сырых смесей при суб-оптимальных соотношениях. Антибиотик представляет особый 1 интерес в качестве агентов усиления роста домашней птицы и животных из-за их широкого бактерицидного спектра. Промотирующая рост активность сырой смеси антибиотиков опрецелялась на молодых поросятах в течение 40 дней. Средний дневной привес, потребление корма и эффективность оказались значительно улучшенными (р 0,01) по сравнению с неполучавшими антибиотиков контрольными животными (табл.1.). Сходные результаты были также получены придаче индивидуальных чистых Соединений 36 926, 27 932 и 37 277 или смесей чистых соединений , приближающихся по своему составу к составу сырых смесей антибиотиков. Эффективность с точки зрения усиления роста была продемонстрирована при проведении опытов на цыплятах, в корм для которых вводили антибиотики. Значительное улучшение (р 0,01) привеса по сравнению с не получавшими препарата контрольными цыплятами наблюдалась для цыплят, получивших в своей диете антибиотики (табл. 2). пример. Одновременно цыплята-бройлеры, самцы однодневного возраста, породы Хаббард, получали кормовые рационы, содержащие бацитрацин (10 г/т ) виргинамицин (10 ч. на 10) и сырую смесь данных антибиотиков, партия 1 (10 частей на 10 ) в течение 21-дневного периода выращивания. Полученные данные показывают. Что виргиниамиция и сырая смесь антибиотиков являются по существу одинаковым с точки зрения улучшения характеристик за период времени в 21 день, а данные, полученные при употреблении бацитрацина, оказались несколько худшими (см. табл. 3). П р и м е р 2. Из 500 однодневных самцов цыплят-бройлеров породы Хаббард были выбраны 360 цыплят для проведения экспериментов. После четырехднейной выдержки цыплят взвешивали, и разделяли на группы для проведения обработки. Цыплят отдельных групп взвешивали через 3-7 дней (см. табл. 4. ) Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о том, что предложенные препараты антибиотиков способствуют усилению роста животных и птиц и вызывают эффективное использование корма по сравнению с другими препаратами антибиотиков.

Таблица 1

Контроль0,35 0,91

Опыт (50 ч. антибиотиков на . корма)0,63 1,35

1 КГ корма на 1 кг привеса

566 939 608 949

Формула изобретения

Способ усиления роста нежвачных «ивотных, включающий введение в корм препаратов антибиотиков, от2,57

2,15

Таблица 2

1,66

1,56

личающийся тем, что, с целью повЕЛшения эффективности способа путем улучшения использования корма животными, в качестве препаратов антибиотиков вводят смесь основ1375130914

ного макроциклического лактона и деп- Источники информадии,

сипептида в соотнсхиении 1:2-1.,принятые во внимание лри экспертизе продуцируемую штаммом Actfnoplanes i Патент США 3780174,кл.424-118,

aurautfcolor АТСС 31011.1973.