Способ получения олигорибонуклеотидов Советский патент 1975 года по МПК C07D51/50 

1

Изобретение относится к усовершенствованию способа получения олигорибонуклеотидов заданного строения.

Известно Специфическое расщепление РНК (рибонуклеиновой кислоты) с помощью гуанил-РНК-азы Т, по остаткам инозина и 2экзо-Ы,Ы-диметиламиногуанозина после предварительной реакции производных гуанозина (Г) и 2-Э:КЗО-М-метилгуанозина с глиоксалем.

С целью получения смеси тринуклеотидов ГфГфАф, ГфГфЦф, ГфГфУф а также этих же тринуклеотидов в индивидуальном состоянии, полирибонуклеотид предварительно обрабатывают Кетоксалем.

Способ основывается на устойчивости фосфодиэфирной связи между гуаниновыми основаниями, модифицированными кетоксалем, и соседним с 3 стороны нуклеотидом при гидролизе с помощью рибонуклеазы TZ- В результате при действия на любые модифицированные полирибонуклеотиды рибонуклеазой Тд образуется фракция тринуклеотидов, которая содержит только смесь ГфГфАф, ГфГфЦф и ГфГфУф. Дальнейшая обработка состоит в снятии модификатора, что достигается простым изменением ipH раствора и, в случае необходимости, .разделением смеси трех тринуклеотидов хроматографическим методом на индивидуальные тринуклеот-иды.

Способ позволяет одновременно получать смесь динуклеотидов ГфУф, ГфЦф, ГфАф, которая может быть легко разделена на индивидуальные динуклеотиды.

При необходимости способ может использоваться для -получения более длинных олигорибонуклеотидов общей формулы (Гф)„Хф, где , Х аденозин (А), уридин (У), цитидин (Ц).

Выход продуктов полностью зависит от природы поЛИрнбонуклеотида, подвергаемого фер,ментативному гидролизу (содержания в пем последовательностей ГфГфАф, ГфГфЦф, ГфГфУф) и составляет 80% от теоретически

возможного.

Если гидролизу подвергается сополимер поли-(У, Г) или поли-(А, Г) или поли-(Ц, Г), то во фракции тринуклеотидов будут сразу индивидуальные ГГУ, ГГА и ГГЦ, соответственно, т. е. отпадает необходимость во втором разделении.

Пример. 2 мг РНК вируса табачной мозаики выдерживают при 37° С в течение 4 час с 1,3 мл 3,25%-ного раствора кетоксаля,

0,05 мл раствора «акодилата натрия (159,98 г/л) при рН 7, 0,125 мл раствора этилендиаминтетраацетата натрия (37,24 г/л). После окончания реакции РНК освобождают от избытка кетаксаля трехкратным осаждением из 70%-ного спирта.

Осадок растворяют в 2,5 мл воды, доводят рН раствора уксусной кислотой до 4,5 и добавляют 0,1 ,мл раствора рибонуклеазы Т, содержащего 600 единиц активности фермента и Выдерживают 2 час прл 37° С. Затем раствор нанасят на колонку, объемом 2,5 мл, заполненную смолой ДЭАЭ - сефадекс А-25.

Смола в Колонке уравновешена буфером А, содержащим, г/л: 2,42 оксиметиламинометана-трис, 1,23 борной кислота, 420 мочевины, рН 7,5.

К колонке подключают раствор из двух последовательно соединенных сосудов, в первом сосуде-буферный раствор А, во втором- буферный раствор Б, содержащий, г/л: 2,42 оксиметиламинометана, 1,23 борной кислоты, 420 мочевины, 15,55 хлористого натрия, рН 7,5.

Скорость протока жидкости через колонку 3 мл/час. С 27 по 33 мл собирают раствор с КОЛОНКИ, содержащий смесь Аф, Цф, Уф и ( - продукт реакции Гф с кетоксалем). С 66 по 90 мл собирают раствор с колонки, содержащий ГфАф, Уф и ГфЦф.

С 105 по 120 мл собирают раствор, содержащий ГфГфЦф, ГфГфАф и ГфГфУф.

Выход динуклеотидов 0,4 мг, тр инуклеотидов 0,15 мг.

В случае необходимости из собранных растворов можно удалить соль пропусканием их через колонку со смолой биогель - PZ или через колонку со смолой ДЭАЭ - целлюлозой.

Предмет изобретения

Способ получения олягорибонуклеотидов общей формулы (Гф)„Хф, где , X аденозин (А), уридин (У), цитидин (Ц), обработкой полинуклеотидов рибонуклеазой TZ и последующим разделением по длине цепи известными приемам и, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, поди рибонуклеотид предварительно обрабатывают кетоксалем.