Изобретение относится к облаети микробиологии и может быть использовано нри проведении массовы.х эиидемиологических исследований, при лнквидации очагов инфекцио.нных заболеваний, при разработке эффективных поливакцин, а также в различных областях микробиологической промышленности. Известен способ идентификации микроорганизмов путем «X культивИрования, отделения выросших клеток с последующим их лизисом, выделения из лизата ДН1, очистки, гибр.идмзации полученной ДНК с ДНК реперного штамма и учета процента гомологии в нуклеотидной последовательно сти. Однако известный способ является трудоемким и длительным (50-60 ч). Цель изобретения - ускорить и упростить способ. Эта цель достигается тем, что лизие клеток проводят при 37-50° С в течение 30-60 мин, ДНК из лизата выделяют 1,5- 2,5-кратным объемом этилового спирта, очистку проводят 0,54-0,6%-ным объемом изопропилового спирта, а гибридизацию ведут в течение 8-10 ч. Пример 1. Суспензию бактериальных клеток Е. соИ ВЗТ, полученную в жидкой глюкозо-минеральной среде, содержащей 6 г NasHPOi, 3 г КН2РО4, 3 г ХН.;С1, 1 лг.; 1 М раствора MgSO4, 4 г глюкозы, 2 ли тимидииа и до 1 л Н2О, фиксируют после осаждения клеток 2-3 объемами 96%-кого этилового спирта, затем суспензию центрпфугируют в течение 10 мин при 3000-5000 об/мин и из осадка отбирают навеску 1 г сырой биомассы. Клетки рес}спендируют в 50 мл солевого раствора (0,3 М NaCl, 0,03/М цитрата натрия), центрифугируют повторно 10 мин при 3000-5000 об/мин и осадок ресуспеидпруют в 20 M.I буфера, содержащего 0,15 MNaCl + 0,1 М ЭДТА-1-0,015 М цитрата натрия +0,1 М триса, рН 8,0 и лизируют добавлением 1 л/л 20%-ного раствора додецилсульфата натрия в прис тствии 100 мкг/мл нроназы в течение 30 мин при 37° С. После завернюния лизиса и просветления лизата добавляют XaCI до конечной концентрации 2 Л1 и осаждают ДНК из лизата 2 объемами этилового спирта. Выпавший осадок ДНК переносят в 10 л(л 1 М ацетата натрия рН 7,0 и поеле растворения ДНК осаждают 1,54%-пым объемом изопропплового спирта (по отношенпю к исходному раствору Юлгл). Выпавший медузообразпый осадок переносят в 10 мл солевого раствора (0,015 М NaCl+ 0,0015 М цитрата натрия). После растворешш ДНК денатурируют, добавляя в раствор по каплям 10 М NaOH до рН 12,0 и прогревая в течение 30 мин при 60° С, нейтрализуют 0,1 н. НС и доводят концентрацию солей в растворе до 0,9 Л1 NaCl + 0,09 Л- цитрата натрия. После этого раствор денатурированной ДНК иронускают через мембранные фильтры, промывают каждый фильтр 10 мл раствора 0,3 М NaCl + 0,03 М цитрата натрия и высушивают нри 60° С в течение 2 ч. ДНК, выделенной на 1 г бактериальной массы, достаточно для нанесения на 10 фильтров. После нанесения фильтры помещают в тефлоновые или стеклянные биксы, содер;кагцие 2 мл раствора 0,3 М NaCl-f 0,03 М цитрата натрия и меченые С-тимидинО М фрагменты ДПК Е. соИ ВЗТ в соотношенни 1: 100 к количеству немеченной ДНК, и смесь инкубируют при 60° С в течение 8 ч. Затем определяют радиоактивность с помощью изотопного счетчика «Marki. Количество реассоцинрованной ДНК (в процента.х) нодсчитываю-т как количество импульсов связавшейся ДНК и эту цифру принимают за 100% в гомологичной реакции (ДНК Е. соИ ВЗТХДНК Е. соИ ВЗТ). Процент гомологии рассчитывают как количество )1 шульсов связавшейся ДНК (в процентах) в гетерологичной реакции, например ДНК Е. соИ 761ХДНК Е. соИ ВЗТ (ренерный штамм) имеет 89% гомологии. Пример 2. Спиртовую суспензию бактериальных клеток Е. coli ВЗТ, соответствующую 1 г сырой биомассы, фильтруют через мембранный фильтр диаметром 10 см с размером пор 0,23-0,45 ммк в течение 2-3 мин под вакуумом, фильтр переносят Б 100 мл солевого раствора (0,15 М NaCl + -i-G,01 М ЭДТА, рН 7), встряхивают 1 - 2мин и повторно фильтруют суспензию через новый фильтр, затем ресуспендируют в 10 мл солевого раствора, содержащего 0.5 М NaCl + 0,1 /И ЭДТА, рН 7,0-8,0. К сус ензпи добавляют 10 мл 1 н. МаОН и выдерживают при ЗТО С в течение 1 ч. К щелочному лизату добавляют 1 каплю универсального индикатора и нейтрализуют смесь оследовательным приливанием 5 мл 1,5 н. IIC1, 5 мл 1 М трис-UCi буфера рН 7,4- 7,8 с 0,05 М ЭДТА н по каплям 2 мл 1,5 н. НС до рН 7,0-7,5. После этого к лизату добавляют 50 мкг.мл панкреатической рибонуклеазы, инкубируют 30 мин нрн 37° С, затем вносят 100 м.кг1мл проназы И инкубацию продолжают в течение 1 ч. Вязкий лизат пропускают 3-5 раз через шпвиц на 50-100 л(л и наносят на мембранные ф.ильтры. Дальнейшие операции после нанесения на фильтры проводят, как в примере 1. Предлагаемый способ прост, так как в нем отсутствуют трудоемкие онерации, сокращает время до 11 -13 ч и обеспечивает высокую точность. Формула изобретения Способ идентификации микроорганизмов путем их культивирования, отделения выросших клеток с последующим их лизисом, выделения из лизата ДНК, очистки, гибридизации полученной ДНК с ДНК реперного штамма и учета процента гомологии в нуклеотидной носледовательности, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, лйзис клеток проводят при температуре 37-50 С в течение 30-60 мин, ДНК из лнзата выделяют 1,5-2,5-кратным объемом этилового снирта, очистку проводят обработкой 0,54- 0,6%-ным объемом изопропилового спирта, а гибридизацию ведут в течение 8-10 ч.
