Препарат фермента Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 

(54) ПРЕПАРАТ ФЕРМЕНТА

делиться от водной среды благодаря сродству с жидкостями, не смешивающимися с водой..

СогласЕЮ предложенному изобретению описывается препарат фермента, представлшощий собой фермент, ковалентно связанный с алкильными группами с длиной углеродной цепи б - 18 или с полимерным носителем, замещенным алкильными группами с длиной углеродной цепи б - 18, об-ладающий свойством ассоциировать с инертной жидкостью, не смешивающейся с водой, который таким образомi

может быть отделён от водной среды.

Под инертной не смешивающейся с водой жидкостью подразумевают жидкость, не реагирующую с препаратом фермента и не вызывакяцую существенного изменения активности фермента.

Ассоциирование препарата фермента с не смешивающейся с водой жидкостью означает любую форму взаимодействия неполярных алкильных групп препарата фермента с молекулами не смешивающейся с водой жидкости, которое приводит к образованию достаточно устойчивой формы для обеспечения возможности отделения препарата фермента от водной среды.

Для получения ; прейаратов согласно настоящему изобретению пригоден любой фермент, например амилаза, аспарагиназа, нейтральная и щелочная протеаза, химотрипсин, целлюлоза, декстраназа, липаза, оксинитрилаза, пепсин, пенициллинацилаза и трипсин.

Предпочтительными ферментами являются липаза, пенициллинацилаза или трипсин.

Алкильные группы, с которыми свйзан фермент, представляют собой углеводородные группы, содержащие по меньшей мере б углеродных атомов, а именно алкильные группы Cj, - CjjV например н-гексил, н-гептил,- н-октил, н-нонил, н-децил, н-додедил, н-октадецил, 4-метилпентил, 4,4-диметилпентил, 3-этилгексил.

Фермент может быть связан либо непосредственно с неполярной алкильной группой, либо при помощи мостика.

У eкoтopыx ферментов связывание алкильных групп непосредственно с молекулой фермента вызывает изменение Структуры и изменение активности фермента. Из-за этого, а в некоторых случаях из-за структуры фермента бывает иногда невозможно привязать достаточное количество неполярньос алкильных групп к ферменту, чтобы придать препарату способность отделяться от водной среды без неприемлемого уменьшения активности фермента.

Поэтогиу предпочтительным является препарат фермента, в котором фермент

ковалентно связан с полимерным носителем или адсорбирован на полимерном носителе, который имеет неполярные алкильные группы зместс (или в дополнение) неполярных алкильных групп фермента. Это позволяет удобно регулировать соотношение неполярных алкильных групп в препарате. Можно также использовать фермент, имеющий достаточное количество неп полярных групп для обеспечения возможности отделения его от водной среды, и полимерный носитель, который может содержать или не содержать дополнительные неполярные алкильные группы.

Под связыванием Фермента с поли1мерным носителем подразумевают как ковалентную связь с полимерным носителем, так и адсорбцию на полимерном носителе, поскольку адсорбция достаточно прочна для удержания фермента на носителе.

Для получения препарата фермента используют как водорастворимые, так и водонерастворимые носители,

5 в случае применения водонерастворимого полимера он должен быть тонко измельчен, чтобы обеспечить большую поверхность для привязки фермента и большую удельную активность препарата,

В качестве водонерастворимых носителей обычно применяют порошок целлюлозы и производные целлюлозы, например ионообменные смолы на основе

5 карбоксимётилцеллюлозы, нейлон, высо комолекулярные полисахариды, например агароза и сшитые декстраны полисахариды, модифицированные модифицирующими агентами, например эпихлор0 гйдрином, или модифицированные для введения карбоксиметильной или аминометильной групп; полиакрилаты и полиметакрилаты. Особенно предпочтительны агароза и макроретикулярно

с сшитые полиакриловая и полиметакриловая смолы.

в качесГве водорастворимых носителей обычно применяют такие полимеры природного происхождения как, например, декстран, декстрины, крахмал, частично расщепленные крахмал или целлюлоза; полисахариды, олигосахариды и сахариды, модифицированные модифицирующими агентами, например эпихлоргидрином.

5 Предпочтительным полимерным носителем является сополимер олигосахарида и эпихлоргидрина, например сахарозы и эпихлоргидрина, так называе№1й Фикол (FicoII) с молекулярным

0 весом около 40000U.

Кроме полимеров природного происхождения, в качестве носителя обычно применяют синтетические водораствориvMe полимеры, например полимеры поливинилового спирта и сополиме ш малеинового или акрилового ангидридрв с Этиленомг стиролом, метилвиниловым .эфиром, дивиниловым эфиром или винилацетатом,

Нгдаболее предпочтительным из водорастворимых сополимеров является 5 сополимер метилвиниловый эфир (малеиновый ангидрид, известный под названием гантрез AN (Gantrez). ; Фермент может быть связан непосредственно с полимерным носителем, Q содержгидим неполярные алкильные группы, или с помощью мостика. Пригодными мостиками являются Сг- С|о алифатический d, ,ijj -диамин, Предпочтительным мостиком является 1,6-диамингек- сан.Количество неполярных алкильннх групп, вводимых в препараты, зависит от ряда факторов. Наличие неполярных групп создает гидрофобное окружение вблизи фермента. Слишком высокая сте- 20 41ень гидрофобности приводит к дезактивации фермента вследствие сопутствующих изменений структуры. Важно найти оптимальное количество неполярйых алкильных групп; с одной 25 стороны - минимальное, обеспечивающее возможность отделения фермента от водной среды, а с другой «стороны - максимальное, обеспечивающее стабильность фермента. Критериями 30 для установления такого равновесия являются: молекулярный вес полимерного носителя молекулярный вес мономера; содержание в полимере ячеек мономера, замещенных неполярными ал- 35 кильными группами; размер неполярных алкильных групп; индивидуальные особенности данного фермента; степень замещения полимера ферментом.

Например, если носителем является гантрез AN119 (молекулярный вес полимера 230000, молекулярный вес мономера 156) и 1 моль гантреза AN 119 связывают с 1 молем пинициллинацилаэы, минимальное необходимое замеще- д ние для эффективного отделения от водной среды наступает, когда около 25% ячеек мономера замещено н-децильными группами, а максимальное замещение, при котором еще сохраняется JQ активность фермента, наступает, когда около 50% мономера замещено н-октадецильными группами.

Способ получения описанного препарата фермента заключается в контактировании фермента с соединением формулы I

R-X,

в которой R --указанная неполярная алкильная группа, а х- функциональная группа, вступающая во взаимодей- 60 ствие с ферментом.

Группа X может представлять собой аминогруппу, карбоксил, альдегид, гидроксил, тиол или -азогруппу, или реакционноспособные связывающие груп- 65

пы, являющиеся, например, производными диальдегидов, например глиоксаля или глицероальдегида и/или диаминов, например 1,6-гексаметилендиамин или этилендиамина, и/или d, и -аминоалифатических карбоновых кислот/ например глициновой или б-аминогексаминовой кислоты, или полимерным носителем, содержащим любую такую функциональную группу. Предпочтительно . X является аминогруппой или же частью, содержащей аминогруппу.

Активная группа фермента, обеспечивающая взаимодействие с группой X соединения R-X, может быть .группой содержащейся на ферменте либо по природе самого фермента, либо введенной модифицированием, как,-например, карбоксил, аминогруппа, тиол или оксифенольная группа, или ангидридные группы.

Обычно взаимодействие соединения формулы I и фермента осуществляют в нейтральной среде рН 4-9 и в температурном интервале от -4 до +40°С, в зависимости от фермента. Предпочтительные рН около 7,0 и температура О - .

Если препарат фермента состоит только из фермента, связанного с неполярными алкильными группами, группа X - производное диальдегида и/или сз( , о -дие1мина.

При получении препарата фермента , содержащего также полимерный носитель, необходимо до привязки к ферменту модифицировать носитель для введения в него неполярной алкильной группы и, если необходимо, мостика.

Препарат фермента,представляющий собой фермент,связанный с модифицированным полимером,МОжет быть получен любым из известных способов привязки ферментов к полимерам, например при помощи таких реагентов, как цианистые соли, в частности бромциан; S-триазины, в частности 2-амин-4,6-дихлор-5-триазин; ацилазиды, диазониевые соединения, например 2-окси3-(п-диаэофенил)-пропиловый эфир; органические цианаты, например фенилцианат; карбодинмиды. Обычно такие связующие агенты применяют сначала для реакции с полимером для создания на нем реакционноспособных групп, которые затем взаимодействуют с ферментом. В некоторых случаях ферменты могут реагировать непосредственно с полимером, например, если последний содерх ит (или содержит после модификации) активные группы, например гшьдегидные группы или азид кислоты.

Обычно процесс получения большинства препаратов фермент/полимер проводят по описываемой схеме. Первой стадией является привязка к полимеру неполярных алкильных групп предпочтительно путем взаимодействил с первичным или вторичным амином RIIH или и мостиков, например d , uJ-Диаминов для последующей привязки к ферменту при помощи диальдегидных; групп. Эти реакции прово noflunep F

ЮШ, или Rj-SH Т1ШСК wi

+Tffl,{CHj)(сн,1х1га

OlOtCH aCHO

|/7o/fi/wpj

f w J-M-CH-tCHj), - CH

где R - неполярная алкильная

группа;

NH2.iCHe)yNHji- A , со-диамин;

CHO(CHg)CHO - диальдегид.

Чайте до привязки неполярных алкильных групп полимер активируют бромцианом.

Предпочтительно прда1енение полимеров, содержащих группы, которые могут быть испольэовац дл связывания с неполярными ал1сИ льню4и труп пами и/или ферментами Йез применения промежуточных мостиков.ГТакие пре- . параты ферментов согласно изобретению не содержат сшитых молекул. СН-СН-СН-СН Ч-Л7Ш1Н,- --сн,-сн-еи-сн гiJ , I I /V 000 TlWffl

ОСНз

-сн.-сн-сн-сн. 1 I где R - алкильная неполярная группа; ENZ - фермент, содержащий ам ногруппу. Полимеры гантрез , например гантрез AN 119 и гант)ёз AN 149, имеют дополнительное Преимущество, которое заключается в том, что они

дят в водном раствора или суспензии в щелочной среде (рН 8-12) при комнатной температуре. Затем фермент, имеиций диальдегидные группы, может быть привязан к модифицированному полимеру в нейтральной водной среде.

KIIR

WH-(GH,)x-N

обусловленных применением мостиков, и имеют некоторые преимущества.

Например, у полимеров на основе мономера-малеинового ангидрида, в частности у полимеров гантрез , ангидридные группы вдоль скелета могут быть использованы для связывания и с иеполярными группами, и с ферментами. Возможно также получение препаратов способом, согласно кото,рому с начале: полимер модифицируют путем привязки неполярных алкильных групп, а оставшиеся в попумврв: ангидридные группы используют затем непосредственно для соединения с фермен- том. Этот способ иллюстрирует следующая схемаi tiOja с-о

оси, I

сн-сн-сн-сн + I I со

COjH COjtt

, ),

X

fiizн-сн-сн-сн 4 I 1 ,V4 растворяются без химического asaliMO действия в некоторых апротонных растворитепях, например Д11метилформамиде, которые являются также хорошими растворителями для аминов . Возможно образование гомогенной реакционной смеси, поэтому такие растворители образуют лучшую реакционную среду для привязки алкильных неполя ных групп к этим полимерам при полу чении препаратов ферментов. Согласно предпочтительному осущ ствлению настоящего изобратения пре парат фермент/полимер получают путе взаимодействия полимера, содержащег в скелете ангидридные группы с амином формулы RNHj. или RjNH, в которо R - неполярная алкильная группа, в апротонном неводном полярном растворителе и последующего связывания модифицированного полимера с ферментомПредпочтительно, чтобы амин реагировал с полимером,в присутствии третичного основания, например пиридина. Предпочтительным неводным апроТОННЬШУ растворителем является N,N-диметилформамид или само третичное основание. Обычно реакцию осуществл ют в интервале температур от комнат ной до 100°С. Модифицированный носитель вьщеляют из среды, в которой он получен путем осаждения менее полярным растворителем, причем наиболее подходящим является диэтиловый эфир, или путем добавления раствора к вод (при этом происходит набухание и гидролиз ангидрида) и отделениягидр лизованного модифицированного полимера от воднЪй среды при помощи не смешивакяцейся с водой жидкости или путем центрифугирования. : Затем фермент привязывают купомянутому отделенному модифицированному носителю путем контактирования модифицированного носителя с фермен том в водном растворе либо с помощью связывающего агента, например карбодиимида. Возможен вариант, при кото ром негидролизованную реакционную смесь или негидролиэованный модифи|цированный полимер, растворенный в небольшом объеме полярного неводного растворителя, добавляют непосредственно к водному раствору фермента. По другому варианту привязка может быть осуществлена сначала обработкой упомянутого негидролизованного носителя гидразингидратом в растворе диметилформамида. Обработан ный носитель, который затем гидролизуют и отделяют от водной среды путем центрифугирования, может быть привязан к ферменту в водной среде с применением активатора нитрита нат рия. в примергос, иллюстрирующих получ ние и свойства некоторых комплексов фермент/полимер согласно предложенно изобретению, приняты следующие сокращения для обозначения полимеров и модифицированных полимеров, ферментов, связывающих групп, неполярных алкильных групп и связывающих агентов. Ферменты: L - липаза; РА -пенициллинацилаза; Т - трипсин. Носители: F фикол; GAN - гантрез; SR - сефароза (Sepharose); TSOOO цекстран Т.2000. Связывающая группа фермент/носитель :HD - 1,6-диаминогексан. Неполярные алкильные группы: D - н-дециламин; DD - н-додециламин; OD - н-октадециламин. Связывающие агенты, активированные агенты и активированные группы: CMC - 1-циклогексил-З-(2-морфолинэтил)-карбодимидметиан-п-толуолсульфонат;G - глутаровый альдегид; А - гидразид. Цифра, стоящая после условного обозначения, указывает номер партии. Например, препарат фермента в примере 1 обозначен PAFHDDG;фермент пенициллинацилаза (РА); носитель фикол - F,- содержащий группы гексаметилендиамина (HD) для связывания с ферментом, а также дециловые группы (D) в качестве неполярных алкильных групп. Привязка свободной аминогруппы гексаметилендиамина к ферменту осуществляется при помощи глутарового альдегида. GAN149HDOD также означает модифицированный носитель, полученный из гантреза 149, модифицированного 1,6-диамингексаном и октадециламином, а PAGAN149HDOD-G означает указанный модифицированный носитель, к которому привязана пенициллинацилаза в присутствии глутарового альдегида. Пример. А. н-Дециламин/ (6-аминогексиламин)-фикол (FHDD). Фикол (5 г) растворяют в воде (300 мл) и доводят рН до 11,0. Добавляют бромциан .(1г) и во время реакции поддерживают постоянный рН путем добавления 2н.ЫаОН. Реакция продолжается 20 мин, после чего ее . прекращают и добавляют раствор н- -дециламина (4 г) - 1,б-диаминогексана (0,5 г) в метаноле (10 мл). Доводят рН до 9,5 при помощи 2н.НС1 и смесь перемешивают в течение 16 ч при 4 С. Образовавшийся коллоидный раствор центрифугируют со скоростью 22000д/л/ч и получают белую гранулу (вес во влажном состоянии 35 г), которую оставляют, и мутный верхний лой, который отбрасывают. Б. Пенициллинацилаза, н-дециламин, (6-амингексиламин)-фикол (PAFHDDG - 1). FHDD - 1 (вес во влажном состоянии 21,6 г) смешивают с 20мл буерного раствора 0,1 М фосфата натрия (рН 6,0) и рН доводят до 6,2

при помощи 2H.HCI. Раствор E.coli пенициллинацилаэы (50 мл; 340 мг частично очищенного протеина) доводят ло рН 6,2, при добавляют 5 мл 25%-мого (вес/объем) водного раствора глутарового альдегида. После перемашивания при в течение 30 мин добавляют суспензию FHDD -1. Смесь перемешивают при 0°С в течение 3 ч при 4с в течение 4 ч, затем охлаждают до и вьэдерживают в течение 16 ч. После оттаивания суспензию центрифугируют при 20000 д/4 °С/45 мин и получают коричневые гелеобраэные гранулы. Гель повторно суспендируют в 30 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,0) и повторно

центрифугируют при 20000 Тш всплывшие верхние слои соединеют и коричневые гранулы (вес во влажном состоянии приблизительно 6,3 г) суспендируют в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия (рН 7,0) и хранят при . При смешении суспензии гранул по меньшей мере с таким же весовым количеством н-деканола они всплывают с деканолом на поверхность водного раствора. Остается нижний слой, не содержащий частиц фермента.

Ферментативная активность гранул верхнего слоя и исходного фермента, определенная с помощью 5%-ного раствора пенициллина G, приведена в табл. 1.

Таблица 1

Получаемый препарат (повторные анализы):

Получают препарат с активностью 43% от начальной активности фермента Активность пенициллинацилазы в

PAFHDPG 1,

методика анализа: пенициллин G (нат иевая соль) растворяют в соответствукяцей концентрации в 20 мл буферного раствора 0,02 М фосфата натрия (рН 7,8) при37С и добавляют пробу фермента; рН поддерживают постоянным путем добавления 0,1 или 0,5 H.NaOH и активность выражают как начальную скорость образования 6-аминпенициллиновой кислоты 6-АРА). При повторном анализе 1,2 мл н-деканола добавляют к перемешиваемой реакционной смеси и после определения суспензию оставляют для разделения на два слоя. Верхний слой удаляют шприцем и используют повторно1 Конечную суспензию центрифугируют пр 2000 д/15 мин и гранулы используют повторно (методика 2). П р и М е р 2.

А. н-Октадециламин, (6-амингексиламин)--фикол (FODHD - 1).

Фикол (5 г) растворяют в воде

(300 мл) и раствор обрабатывают цианбромидом (1 г) рН 11,0 аналогично примеру 1. через 20 мин рН раствора доводят до 10,0 с помощью 2H.HCI и добавляют раствор н-октадециламина

(5 г) и 1,6-диамингексана (0,5 г) в метаноле (20 мп). Затем рН раствора снова доводят до 10/0 с помощью 2н,НС1, смесь перемешивают при в течение 72 ч. Продукт центрифугируют при 20000 .д/4С/45 мин. Получёиот рыхлые белые гранулы (25 мл) и прозрачный верхний слой с поверхностной пленкой (октадециламин). Б. Пенициллинацилаза, н-окталецил амин, (б-амингексиламин)-фикол {PAFODHDG -1). Доводят рН йенициллинацилазы (25 мл; 170 мг протеина) до 6,2 при комнатной температуре, затем добавля ют 2,5 мл 25%-ного глутаровогб альде гида (вес/объем).Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15 мин, добавляют FODHD - 1(10 мл)и доводят рН суспензии до 6,2 с помощь 2н.НС1.После перемешивания при 4°С в течение ,3ч материал центрифугируют при 20000 мин. Розовые гранулы повторно суспендируют в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия (рН 7,0) и хранят при . Суспензия заметно всплывает при смешивании с н-деканолом, ее активность приведена в табл.2. Восстановление активности составляет приблизительно 60%. (Методика анализа аналогична табл.1) Таблица 2 Исходный фермент Получаекый препарат (повторные анализы); методика 2 Пример 3. А. н-Дециламин, (6-амингексилйм декстран Т2000 -(Т 2000 HDD-1). Декстран (средний мол. вес 2000000; 10 г) растворяют в воде (800 мл) и аналогично активируют бромцианом (2,5 г). Через 20 мин добавляют н-дециламин (5 г) и 1,6 дяамингексан (1,0 г) и доводят рН До 10,0. Раствор перемешивают п в течение 16 ч и затем центриф гируют при 20000 ч 30 мин Образовавшиеся гранулы повторно су пендируют в 0,1 H.HCI (100 мл) и с ва центрифугируют при 20000 д/л/ч Вторые гранулы (вес во влажном сос тоянии 50 г) оставляют, Б. Пенициллинацилаза, н-децилai«aiH, (б-амингексилймин)-декстран Т2000 (PAT2000HDDG - 1). Т2000 HDD - 1 (10 г) во влажном состоянии гомогенизируют в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия, рН 6,0. и рН суспензии доБодят до 6,2, рН пенициллинацилазы (50 мл; 340 мг протеина) доводят до 6,2 и добавляют 5 tvi 25%-ного (вес/объем) глутарового альдегида. Этот раствор перемешивают в течение 45 мин при и затем добавляют ,Т2000 HDD. Смесь перемешивают при в течение 30 мин и затем хранят при в течение 16 ч. После оттаивания суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч и заетм центрифугируют при 6000 д/22С/30 мин. Всплывший слой оставляют и гранулы повторно суспендируют в 75 мл 0,1 М фосфата натрия (рН 7,0) и гомогенизируют. После центрифугирования, последующего повторного суспедирования и следующего центрифугирования получают коричневые гранулы (вес во влажном состоянии 8,0 г). Они хорошо всплывают при смешении с н-д«канолом и хуже при смешении с н-гептаном. Активность препарата приведена в табл.3. Приблизительно 10% первоначальной активности фермента сохраняется в конъюгате. (Методика анализа аналогична табл.1). Таблица 3 Исходный фермент РАТ2000Н DDG-1 1 0,875 Всплывший слой10,022 РМ2000Н DDG-1(0,5)0,270 Получаемый .препарат (повторные анализы): методика 2 (0,5) 0,155 П р и М е р 4 . А. н-Дециламин, (6-амингексиламин)сефароза 4B(SRHDD-1). Активирования бромцианом сефароза 4В (2г в сухом состоянии) набухает в 50 мл-10 H.HCI при в течение 15 мин, затем ее промывают на стеклянном агломерате 2x100 мл -10 н.НСР. Гель добавляют к 0,1 М раствору бикарбоната натрия (20 мл), этанола (5 мл), н-дециламина (0,5 г) и 1,6-диамингексана (0,1 г). Смесь медленно встряхивают при в течение 16 ч и затем отфильтровывают на стеклянном агломе1 ате. Гель промывают 4x20 мл lO i-uHCIf 4x200 глл этанола 4x50 мл воды; затем повторно суспен дируют в воде и хранят при . Б, Пенйциллинацилаэа, н-децилами (6-;.:№HVexcKjraMHH) -сефароза 4В PASRHDDG -1) . Внсушенпый под разрежением гель SPJIDD (1,5 г) суспендируют в 5 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 6,0), затем добавляют 0,5 МП 25%-ного (вес/объем) глутаро го альдегида. Смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температу ре, затем высушивают под разрежени ем в стеклянном агломерате. Затем гель добавляют к смеси пенициллинацилазы (2 мл; 13,6 мг) и буферног 0,1 М раствора фосфата натрия, рН (З.мл). Эту смесь перемешивают в течение 24 ч при , отсасывают досуха и пpo ывaюf на стеклянном агломерате 5x2Q мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,0. Ее суспендируют в 5 мл того же буф ного раствора,; Образовавшиеся нири всплывают с н-деканолом в противоположность сефарозе, которая осажд ется из водных суспензий, содержащ н-деканол. Активность этого препарата прив дена в табл.4. Приблизительно 72% первоначальной активности сохраняе ся в конъюгате. (Методика анализа аналогична табл.1). Таблица 4 Исходный фермент PASRHDDG--1 jПoлyчaвмJdй препаipar (повторные анализы) : методика 2 методика 1 . и М е р 5. н-Дециламинглута раль-пенициллинацилаза (PADDG-1). Доводят рН пенициллинацилазы (40 мл; 272 мг) до 6,2 и добавляют 4 мл (вес/объем) глутаров го альдегида. После перемешивания в i/течение 20 мин при О С добавляю н деканол (6 мл) и н-дециламин ( tJOi} и продолжают энергичное пе ремешивание при в течение б ч и при комнатной температуре в течен Смесь центрифугируют при 2000 мин. Образуется коричневый верхний слой, который отделяют и хранят суспендированным в 30 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,0. Материал спонтанно всплывает на поверхность водных суспензий, но он менее диспергируется, чем полимерные конъюгаты, и проявляет тенденцию к образованию крупных агрегатов. 1 МП суспензии, анализированной как в примере 1, показывает активность 0, моль/мин, что соответствует 42% сохранения активности ацилазы в конъюгате. Пример 6. Трипсин-н-октадециламин, (6-амингексиламин)-фикол (TFODHDG-1). Трипсин (50 мг), не содержащий солей, растворяют в 20 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 6,0) при . Добавляют 1 мл 25%-ного (вес/объем) глутаровоЪо альдегида и смесь перемешивают в течение 15 мин при . Добавляют 10 мл FODHD-1 (см, пример 2А) и рН раствора доводят до 6,2 при помощи 2H.HCI. Смесь перемешивают в течение 16 ч при 4С и затем центрифугируют при 20000д/ /40 С/30 мин. Гранулы повторносуспендируют в 20 мл воды и фильтруют с применением фазоразделительной фильтровальной бумаги Whatman JPS. Остаток на фильтре повторно суспендируют в 10 МНС1 (20 мл) и снова фильтруют. Затем дважды проводят суспендирование (Ю MHCI) и центрифугирование (10000 g/14°C/2Q мин) и получают 2,65 г коричневого геля. Этот материал всплывает и с н-деканолсм, и с н-гептаном. Методика анализа активности следующая . N- сА -бенэил-ВЪ-аргинин-п-нитроанилид растворяют в диметилформамиде (5 М.П) и добавляют к 0,05 М трехзамещенному буферному раствору (рН 8,3), содержащему Ю.молей CaClg) . Получают Мраствор хромогенного субстрата. Добавляют н-гептан (5 мл) и смесь энергично перемешивают при . Добавляют пробу фермента и через равные интервалы отбирают по 5 мл аликвотной части смеси. При недолгом стоянии или осторожном центрифугировании отделяют гептановый слой (вместе с TFODHDG-1). Эижний водный слой отделяют и измеряют оптическую плотность при длине волиы 400 нм для определения остаточиого паранитроанилида, В некоторых случаях нижний слой разбавляют для облегчения измерения адсорбции. После анализа гептановый и водный слой добавляют к перемешиваемой реакционной смеси. Общая активность конъюгата составляет 17% от первоначгшь ной активности.

Пример 7. Липаза-н-дециламин, (б-амингексиламин)-декстран .T200Q (T2000HDDG-1).

Липазу из Candida Cylindracea (200 мг)растворяют в 20 мл 0,1 М ра.створа фосфата натрия,рН 6,0.Затем ;рН доводят до 6,2. Добавляют 2 мл .23%-ного (вес/объем) глутарового альдегида, и смесь перемешивают в течени 30 мин при комнатной температуре. T2QOO HDD-1 (см. пример 3) осаждают из суспензии действием этанола и осадок оставляют повторно набухать в воде. 10 г образовавшегося геля гомогенизируют в 20 мл 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 6,0. Затем добавляют к смеси фермент-глутаровый альдегид, рН доводят до 6,2 и смесь перемешивают ;при 4°С в течение 16 ч. Суспензию центрифугируют при 20000 д мин, гранулы повторно суспендируют в 50 мл 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,0) и повторно центрифугируют. Эту методику повторяют еще два раза. Конечные гранулы (вес во влажном состоянии 3,4 г) повторно суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,0. Суспензия всплывает и с н-деканолом, и с н-гептаном.

Методика анализа активности следующая.

5 мл п-нитрофениллаурата (10 М в н-гептане) быстро перемешивают с 20 мл 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 8,0) при комнатной температуре. При этих условиях неферментный гидролиз сложного эфира не наблюдается. После добавления фермента через равные промежутки времени отбирают по 5 мл аликвотной части, центрифугирую при 4000 д/1 мин 30 с и нижний(водный) слой отделяют.

Оптическую плотность при длине волны 400 нм определяют точно через 3 мин после отделения аликвотной части. Затем водный и гептановый слои добавляют к перемешиваемой смеси, (Так как в данном эксперименте субстрат содержится в неводной фазе, скорость перемешивания должна оставаться постоянной в течение всего эксперимента).

Приблизительно 1% начальной активности липазы обнаруживают в конъюгате.

П р и М е р 8.

А. GAN149HDOD-1.

н-Октадециламин (1г) и 1,6 диамингексан (0,2 г) суспендируют в метаноле (10 мл) и добавляют к 200 м буферного 0,2 М раствора фосфата наттрия (рН 8,0), содержащего метанол (40 мл). Добавляют гантрез 149 (2г) маленькими порциями при энергичном перемешивании. Смесь перемешивают в течение 16 ч при комнатной темпераtrype и затем центрифугируют при

12000 д/1 ч при комнатной температуре. Поверхностную пленку и верхний слой отбрасывают, а гранулы повторно суспендируют в. 100 мл буферного . 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,0) и повторно центрифугируют аналогично указанному.

Гелеобразные гранулы (80 г) хранят при .

Б. PAGAN149HDOD-1-G.

Доводят рН раствора пенициллин0ацилазы (20 мл; 1,36.10 ед.; 136 мг протеина) до 6,2 и добавляют 2 мл 25%-ного (вес/объем) глутарового альдегида (водного). Смесь перемешивают при комнатной температуре и

5 добавляют 10 г суспензии GAN149HDOD-1 в 12 мл буферного 0,1 М раствора натрия, рН 6,0.

Поддерживают рН 6,2 и продолжают перемешивание при комнатной темпера0туре в течение 2ч. Суспензию центрифугируют в течение 1 ч при 20000 д/ /4°С,.а гранулы (14 г) сохраняют. Гранулы повторно суспендируют в 10 мп 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,0)

5 и повторно центрифугируют. Конечные гранулы хранят при 4°С.

Удельная активность: : 3-lp - молей 6-АРА (5%-ный пенициллин G; рН 7,8; .

0

Активность после регенерации 21%. Всплывает с н-деканолом или н-деканом.

П р и М е р 9.

А. GAN149HDOD-2.

н-Октадециламин (5 г) растворяют в этаноле (50 мл) и добавляют к 1л буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 9,0), содержащему этанол (200 мл). Добавляют гантрез 149 (5 г) маленькими порциями в течение 45 мин при перемешивании, рН поддерживают в интервале между 8 и 9 при помощи 2 H.NaOH. После добавления гантреза добавляют 1,6-диаминогексан (5 г) и смесь перемешивают при комнатной температуре- в течение 6 ч, рН понижают до 3,0 при помощи концентрированной HCI и суспензию центрифугируют при 12000 д/1 ч при комнатной температуре. Верхний слой отбрасывают и гранулы повторно суспендируют в воде (550 мл) и повторно центрифугируют, получают конечные белые гранулы (150 г), которые хранят при 4°С,

Б. PAGAN149HDOD-2-G.

Раствор пенициллинацилазы (100 мл; 9,8-10 ед.; 88 мг протеина) смешивают с GAN149HDOE -2 (15 г), буферным 0,1 М раствором фосфата натрия (рН 6,0; 20 мл) и 2%-ным (вес/объем) азидом натрия (1 мл) и быстро гомоДоводят рН смеси

генизируют при О

до 6,8 при в течение 4 ч 30 мин и за-х-ем центрифугируют при 20000 д/4}У Г1 ч) .

Гранулы повторна суспендируют в 0,1 М растворе фосфата натрия .. (рН 7,0) и повторно центрифугируют. Эти операции повторяют и получают KO ie4Hbie гранулы; вес 11,2 г; хранение при ..

Удельная активность: 1,8-10 мол б-АРА. г (условия аналогичные) Активность после регенерации 55%. Всплывает с н-деканолом или н-деканом) .

-Пример 10. Трипсин н-Двциламин-гантреэ AN119 (TGAN 119D). .

Гантрез AN119 (1 г) растворяют в диметилформамиде (ДМФ) (5 мл) и эие гично перемешивают. Добавляют н-дециламин (0,8 г) в ДМФ (1 мл). Раствор становится более вязким. После перемешивания:в течение 10 миН раствор по каплям добавляют к раствору бычьего трипсина (300 мл) в буферно 0,1 М растворе .фосфата натрия (рН 8,0; 60 мл) при 22-®С. Поддерживают рН постоянным при помощи 2 н гидроокиси натрия, затем добавляют хлорид натрия (4 г). Образовавшуюся суспензию выливают в 176 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,6) и охлаждают до . Добавляют сульфат аммония (50 г) и смесь пе эемешивают при 4 С в течение 20 мин. Смесь центрифугируют при V 25000 ч и гелеобразные гранлы повторно гомогенизируют в 30 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,6. Повторяют центрифугирование, затем цикл гомогенизация/центрифугирование повторяют еще дважды, получгиот конечный рыхлый гель (7,5 г). Препарат анализируют спектрофотометрически с применeиием Н-бензил-Ь-аргинин-п-нитроанилида (ВА NA), 2 ммоля в буферном 0,1 М растворе веронала, рН 8,3 при . Одна единица соответствует повышению оптической плотности на 0,001 ед./мин при 400 им. Так как гель вызывает значительное рассеяние света, необходимо периодически встряхивать кювету (длина кюветы 1 см).

Активность геля: 168 ед./мг во влажном состоянии, 2000 ед./мг в сухом состоянии (лиофилизованный -гель),

А тивность после регенерации 24,2.-.

Иммобилизация ферментного конъюгата на капельках-растворителя.

Гель:(1 г во влажном состоянии) гомогенизирует в небольшом дефибрере с 25 мл н-декана и 10 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 8,0) при 4000 об/мин и температурз в течение 5 мин. Образовавшаяся молочная суспензия после выдержки в течение 3 ч при разделяют на верхний слой, состоящий из

плотно упакованных капелек декана, и нижний водный слой. Оба слоя анализируют упомянутым спектрофотометрическим методом. Кювету встряхивают через равные промежутки времени 5 при анализе верхнего слоя и измеряют среднюю скорость увеличения оптической плотности.

Активность верхней фазы 2280 ед./мл. Активность нижней фаQ зы 57 ед./мл.

Так как при измерении данным методом кажущаяся активность верхней фазы гораздо меньше ее истинной активности, полученный результат показывает, что по меньшей мере 90% активности трипсина ассоциировано с капельками растворителя.

Пример 11. Пеницшшинацилаэа, н-октадециламии-гантрез ANH9 (PAGAN 119D).

0 Гантрез AN119 (0,5 г) растворяют в диметилформамиде (2,5 мл) и подогревают До 80°С на водяной бане. Октадециламин (0,28 г) тбже растворяют в диметилформамиде (2,5 мл) при

5 и быстро добавляют к еще горячему раствору гантреза. Смесь перемешивают и добавляют пиридин (0,1 мл). . После охлаждения до комнатной температуры в течение 1 ч весь раствор

0 добавляют;к пенидиллинацилазе

(175 мг) в воде (30 мл) при рН 7,0 и быстро гомогенизируют при .

Затем смесь розового цвета перемешивают при в течение 3 ч, рН

5 поддерживают постоянным при 4С в

течение 16 ч, растворяют хлорид натрия (5,8 г) в суспензии и смесь центрифугируют при 25000 g/0°C/l ч. Образовавшиеся малиновые гранулы весят

0 4,0 г. Их повторно суспендируют в 20 МП буферного 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,0.

Удельная активность этой суспен;;; зии, определенная с применением 5%

(вес/объем) пенициллина G в буферном (20 мл) 0,02 М растворе фосфата натрия (рН 7,8) при , составляет 4, моль/мин/мл. Это соответствует приблизительно 70% регенерированной активности в конъюгате. Описанную суспензию (4,0 мл) смешивают с буферным 0,02 М раствором фосфата натрия (20 мл) и н-деканолом (5 мл) и гомогенизируют при 4000 об/мии в течение 5 мил при . .Эмульсию центрифугируют при 100 д,комнатной температуре в течение 20 мин и разделяют на верхнюю органическую эмульсию и нижний водный слой. Нижний слой оставляют, а.верхний слой повторно суспендируют в буферном 0,02 М растворе фосфата натрия (20 мл) и повторно центрифугируют. Первоначальный нижний слой имеет общую активность 1,2510 моль/мин, а промытый верх5 НИИ слой - 9,5-10 моль/мин, ртношение удельной активности {по объ 21,6 (верхний слой/нижний слой). После определения активности опис методом органический слой обрабат вают повторно путем осторожного ц рифугирования и отделения от водя ного слоя. Начальная активность фазы РАСАМ11900-н-деканол при последов тельных циклах флотации и повторно использования приведена в табл.5. Пример 12. Пенициллинаинла эа, н-додециламин-гантрез AN119 . (PAGAN 119DD) . н-Додециламингантрез AN 119 (0,25 г) растворяют в диметилформами де (1 мл) и добавляют к раствору пенициллинацилаэы ( 100 мг в 14 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия, рН 7,0). После недолгой гомогенизации при О С суспензию перемешивают в течение 16 ч при 4 С. К раствору, ставшему гомогенным, добавляют при 4 С сульфа аммония (7,8 г), поддерживая постоян ный рН 7,0 при помощи 1 М раствора карбоната натрия. После растворения сульфата аммония образуется мутная суспензия. Этот материал центрифуги|руют при 25000 1 ч. Гранулы повторно суспендируют в растворе сульфата аммония (7,8 г) в воде (30 мл), рН 7,0 и центрифугируют. Конечные гранулы (1,36 г) повторно растворяют в воде (10 мл) с образованием вязкого раствора. Активность гранул, определенная указанным методом, составляет 1,62x10 моль/мин/ /г веса во влажном состоянии, что составляет 80% регенерированной активности. Иммобилизация водорастворимого конъюгата на капельках н-деканола:

Активность,

Цикл % 1 МП указанного раствора растворяют в 0,02 М буферном растворе фосфата натрия (20 мл) и гомогенизируют н-деканолом (10 мл) при 400 об/мин в течение 3 мин прн . Эмульсию разделяют на слои путем центрифугирования при 300 д/10 мин. Верхний слой имеет общую активность 1,14x10 моль/мин. Активность слоя после повторения последовательных циклов показана в табл.6. Во втором эксперименте 2 мл раствора конъюгата фермента гомогенизируют при тех же условиях с н-деканолом (2,5 мл) и буферным 0,02 М раствором фосфата натрия (10 мл). После центрифугирования и промывки тем же буферным раствором верхний слой имеет активность 1,8-10 моль/мин, а первоначальный нижний слой - 8,010 моль/мин. Отношение удельной активности (верхний слой/нижний слой) на основе объемов составляет 7,5. Начальная активность фазы РА GAN 119 DD-н-деканол при последовательных циклах флотации и повторного использования приведена в табл.6, Таблицаб Пример 13. Трипсин, гидролизованны } н-октадециламингантрезом AN149 (TGAN 149 DCMC). Набухший гель полимера (15 г) смешивают с. буферным 0,1 М раствором фосфата натрия, рН 7,0. Затем доводят до 4,7 при помощи 2 н.соляной кислоты. Добавляют 1-циклогексил-3-(2-морфолинэтил)-карбодиимидм-п-толуолсульфонат (0,3 г), поддерживают рН 4,7 при помощи 2H.HCI, после выдержки в течение 5 мин при комнатной температуре добавляют бычий трипсин (75 г в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия; рН 7,0; 2 мл), доводят рН смеси до 5,9 и поддерживают такой рН в тече.ние 1 ч при помощи 2 н.гидроокиси натрия. После выдержки в течение 3 ч при комнатной температуре гель центрифугируют при 25000 д/30 мин/ /4с. Гранулы повторно суспендируют в 40 мл буферного 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 7,0) и повторно центрифугируют. Конечные гранулы смешивают с описанным буферным раст вором (15 мл) и н-деканом (10 мл) и быстро 1: омогенизируют. В результате этой процедуры образуется не полная дисперсия, и смесь подвергают действию звука при 20 кгц (5 импульсов с интервалом в 5 мин) с периодическим охлаждением во льду. Конечную эмульсию центрифугируют пр 100 д/15 мин. Верхний слой трижды промывают фосфатным буфером (25 мл) Конечный объем верхнего слоя 11 мл, а активность, определенная как в примере 3, .1050 BANA ед./мл. Кажущаяся регенерированная активность .. 50%. Пример14. А. Гидролизованный н-октадециламин-гантрез АЫ119-гидразид (GAN 119 ООН). Гантрез AN 1-19 (5 г) растворяют в диметилформамиде (20 мл) и нагревают до на водяной бане. Добав ляют раствор н-октадециламина (2,8 г)в горячем () диметилформ амиде (30 мл) и смесь поддерживают при температуре приблизительно 60 С в течение 1ч. После охлаждения до комнатной температуры раство добавляют к смеси гидразингидрата (10 мл) и диметилформамида (50 мл) при комнатной температуре. Образует ся незначительный коричневый осадок смесь перемешивают в течение 10 мин и добавляют воду (500 мл). Получают мыльный зеленьй раствор, после пере мешивания в течение 10 мин рН доводят до 7,0 при помощи концентрирова ной HCI, затем добавляют хлорид нат рия (50 г) . Образую тся хлопья,и суспензию центрифугируют при 10000 д/30 мин/4 С. Гранулы повторн суспендируют в воде (400 мл), перемешивают в течение 16 ч при 4С и затем центрифугируют. Образуются серо-голубые гранулы (вес во влажном состоянии 39 г). Б. Пенидиллинацилаза, н-октадециламин-гантрез АМ119-гидразид, связа1 ный PAGAN119ODH. GAN119ODH (5 г во влажром состо янии), суспендируют.в 2 н.НС (50 ил) и перемешивают в течение 15 мин при . Добавляют раствор нитрата натрия (0,5 г) в воде (5 мл и С1«1есь перемешивают при 0°С в течение 10 мин, затем центрифугируюг при 25000 д/30 мин/О°С и гранулы повторно суспендируют в 30 мл буфериогО. 0,1 М раствора фосфата натрия (рК 8,0) при . Эту суспензию добавляют к раствору пенициллинацил .эы (100 мл; 55 мг протеина) и доводят рН до 8,0, Суспензкю перемешива при 4°С в течение 72 ч и затем цент рифупфуют при 25000 д/1 ч/0°С, пов торно суспендируют в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия, рН 7,0 и повторно центрифугируют. Вес конечных гранул 3,74 г. Удельная активность (анализ выполняют по описанной методике): 5,2х10 моль/мин/Го Восстановленная активность 32,5%. Суспензию указанного конъюгата в буферном 0,1 М растворе фосфата натрия (рН 7,0; 0,29 г/мл 2,5 мл) смешивают с 20 мл буферного 0,02 М раствора фосфата натрия (рН 7,8) и гомогенизируют с н-деканолом (7,5 мл) при в течение 2 мин, затем центрифугируют при скорости 5000 об/мин (100 г, 10 мин), Йри этом образуется 2 слоя. Общая активность нижнего слоя 1,8-10 моль/ /мин, а активность верхнего слоя после промывки указанным буферным раствором (20 мл) 1,9-Ю моль/мин, : Отношение удельной активности верхний слой/нижний слой (по объему) 30, Начальная активность фазы PAGAN1190ВН-н-деканол при последовательных циклах флотации и повторного использования приведена в табл.7. Т а б л и .ц а 7 Активность, Формула изобретения 1.Препарат фермента, представляющий собой фермент, ковалентно связанный с алкильными группами с длиной углеродной цепи 6-18 или с полимерным носителем, замещенным алкильными группами с длиной углеродной цепи 6 - 18, обладающий свойством ассоциировать с не смешивающейся с водой жидкостью при контактировании препарата с последней в водной среде. 2.Препарат по п. 1, отличающи.йс я тем, что полимерный носитель представляет собой полисахарид. 3.Препарат по п. 2, о .т л и чающийся тем, что полимерный носитель представляет собой декстран или сефарозу, 4.Препарат по п. 2, отличающийс я .тем, что полимерный носитель является сополимером олигосахарида и эпихлоргидрина. 5.Препарат по п, 4, отличающийся тем, что полимерный ,носитель является сополимере сахарозы и эпихлоргидрина.

6,Препарат по п. 1, отличающийся тем, что полимерный носитель содержит ангидридные группы на скелете полимера.

7,Препарат по п. 6, отличающийся тем, что полимерный носитель является сополимером метилвинилового эфира и малеинового ангидрида .

8,Препарат по любому из п. 1-7, отличающийся тем, что фермент представляет собой липазу, пенициллинацилазу или трипсин.

что фермент связан с неполярными группами или с полимерным носителем, замещенным неполярными группами при помощи мостика.

Источники информации, принятые 1во внимание при экспертизе

5

2,Патент Великобритании

№ 1284925, кл. С 07 G 7/02, 1974 (прототип).