Способ получения 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1н-тетразол-5-ил)тиометил- @ -цефем-4-карбоновой кислоты или ее солей со щелочными металлами Советский патент 1982 года по МПК C12P35/08 A61K31/546 C07D501/57 

3 g Цель изобретения - получение нов антибиотиков цефалоспорийового ряда расширяющих арсенал средств воздействия на живой организм. Эта цель достигается способом получения соединений формулы I, который заключается в том, что культи вируют продуцирующий 7-метоксицефалоспориновый антибиотик микроорганизм, принадлежащий к виду Streptomyces, в культуральной среде, содер жащей питательные вещества, с добав лением 1-метил-1Н-тетразол-5-илтиол формулы ,1 или его соли, или его дисульфидного соединения формулы Таким образом целевое соединение с 1-метил-1Н-тетразол-5-илтиометиль ной группой в положении 2 цефалоспо рина можно получить непосредс твенно за одну стадию-ферментации. Соединение 1 обладает высоким .противомикробным действием, Противо микробный спектр соединений можно р ширить или изменить, заменив бокову цепь - ациальную группу в 7-ом поло жении формулы (1Н-(СН2)з- 50другой ациальной группой, например сС-аминофенилацетильной группой,сС-карбоксифенилацетильной группой, оС-сульфофенилацетильной группой,о(-оксифенилацетильной группой, пиридилтиоацетильньй группой, тиадиазолилтиоацетильной группой, триазолил ацетильной группой, цианметилтиоаце тильной группой, трифториетилтиоацетильной группой и т,п., таким образом предлагаемое соединение так же пригодно как промежуточное соеди нение для получения этих производны с этими ацильными группами, например, 7(2-Цианметилтиоацетамидо-7 -метокси-3-{1-метил-тетразол-5-ил)-тиометил-А -цефем-(-карбоновай кислота и 7 -метокси-3-(1-метилтетразол-5-илтиометил)(-трифторметилтиоацетамидо)- -цефем- -карбоновая кислота. Примером микроорганизмов, полезных при получении 7-метоксицефалоспориновых антибиотиков, относящих- ся к Streptomyces, может служить новый штамм StreptomyCes Oganonensis V-G 19 Z, ранее выделенный из почвы в Огано-Тауне, Химибугун (профектура Саитама, Япония), Этот штамм сдан на хранение в институт микробиологической промышленности, ёгенство промышленных наук и технологии Министерства международной торговли Японии под1 °РЕКМ-Р 2725,а также в американскую коллекцию типовых культур, 12301 Парклоун Драйв Гоквилл, Мериленд 20852, США, под номером АТСС ЗП67. Ниже приведены микологические свойства этого штамма. 1.Морфологические характеристики штамма S. Oganonensis V-G 19 Z Он растет как в природной, так и в искусственной среде с образованием хорошо разветвленного субстратного мицеллия, в то время как образование воздушного мицелия недостаточно и поэтому образование спор плохое. Цепи спор прямые., относятся к типу R(Rectus) или RF (Rectiflexibiles), в каждой цепи по 10-50 спор. Споры элиптические, сферические или цилиндрические по форме, размер 0, - 0,60x0,55 - 0,90 мк. Поверхность спор гладкая. Не наблюдаются флагеллатные и спорангиевые споры. 2.Культуральные характеристики штамма S.Oganonensis V-G 19 Z приведены в табл.1. 3. Физиологические свойства штамS.Oganonensis Y-G 19 Z« Образование тирозиназы Отрицательное Восстановление нитрата Положительное Положительная, Коагуляция слабая сливок Положительная, Пептонизация слабая сливок Гидролиз Полоухи тельный крахмала Положительное, Ожижение слабое желатина 5Э Разложение Отрицательное целлюлозы Гемолиз Положительный Солюбилизация малеата кальция Положительная Утилизация углеродных соединений S, oganonensis Y-6 19 Z. Источник ухлерода Утилизация Глюкоза+ Арабиноза + Сахароза Ксилоза« Инозитол Манитол+ Фруктоза+ Рамноза Рафиноза )(арактерные особенности штамма Streptomyces oganonensis V-G 19 Z следующие: относится к нехромогенному штамму Streptomyces; воздушный мицелий прямой без мутовки (типа R или RF) , споры сферические или элип тические, спорйвая поверхность глад кая; дает светло-желто-серую до све ло-желто-коричневой культуры на раз личных средах, цвет воздушного )це ЛИЯ коричнево-белый, желто-бель 1 и желто-серый, продуцируется антибиотик V-G 19 Z-ДЗ, относящийся к гоксицефалоспориновой группе. При изучении известных штаммов с такими свойствами наиболее близким является Streptomyces globlsporus. Однако, при сравнении с S.glob is porus штамм V-G 19 Z отличается от него по следу 01цим пунктам, показанн в табл.2о Из данных таблицы видно, что пред лагаемый штамм является новым штаммом, отличающимся от известного.. Как и Streptomyces ooanonensis, относящиеся к роду Streptomyces, ни жеследующие штаммы продуцируют 7-ме токсицефалоспориновые антибиотики: Streptomyces griseus, Streptomyces virldochromogenes, Streptomyces flm briatus, Streptomyces halstedii, Streptomyces rochel, Streptomyces cinnanranensis, Streptomyces lactamdurans, Streptomyces HpmanU, .Stre tomyces clavuligerus, Streptomyces wadayamensis, Streptomyces jumonjinensis, Streptomyces heteromorphus, Streptomyces panayensis и Strepto- . myces chartreusis. Однако предлагаемые штаммы не ограничены выше указанными штаммами, можно применять и любые штаммы, относящиеся к роду Streptomyces и продуцирующие 7 метоксицефалоспориновые. антибиотики. 1-метил-1Н-тетразол-5-илтиол (II) можно применять в виде его неорганических солей, таких как соли щелочных металлов, щелочноземельных металлов, аммониевые соли и т.п,, и солей органических оснований, таких как соли триэтиламина, триэтанояамина, дициклогексиламина, лизина, аргнина,.гистидина, основные водорастворимые антибиотики, например, канаминин, алкалоид, основной протеин и т,п. Соли, имею«1ие высокую растворимость в воде, могут использоваться выборочно. Кроме того, может быть использовано дисульфидное соединение 1-метил- 1Н-тетразол-5-илтиола (И I). Культивирование ведут по обычным методам для всех микроорганизмов, но лучше вести погружное культивирование в жидкой культуре. Ножно применять любую культурапьную среду, содержацую питательные вещества для продуцирующих 7 метоксицефалоспориновые антибиотики штаммов, относящихся к роду Streptomyces. В качестве источника углерода в ней можно использовать глюкозу, сахарозу, маннитол, глицерин, декстрин, крахмал, растительные масла и т.п., в качестве источника азота - мясной экстракт, цептон, глютемовую муку, муку из хлопковых семян, соевую муку, арахисовую муку, рыбную муку, кукурузную муку, сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, сульфат аммония, нитрат аммония, мочевину и другие органические и неорганические источники азота. В культуральную среду можно также добавлять при необходимости металлические соли, например сульфаты, нитраты, хлориды, карбонаты, фосфаты и т.п., Na, К, Мд Са, Zn и Fe, а также вещества, облегчающие образование антибиотиков, или противовспенивающие агенты, например метионин, цистеин, цистин, метилолеат, лярд, силиконоваое масло, поверхностно-активные вещества и т.п. 1-Метил-1Н-тетразол-5-ил-тиол (II) или его соль, или его дисульфидное соединение (II) обычно добавляют в концентрации 0,1-5 мг/мл (лучше 0,5-2 мг/мл тиола). В культуральную среду их можно добавлять один раз перед культивированием или порциями в начальной стадии культивирования. Желательно вести культивирование в аэробных условиях при температуре культивирования 18-35 0 (луч ше 30 С). Кроме того, желаемые результаты получают при рН культуральной среды (лучше 6-8)„ Длительность культивирования зависит от состава и температуры применяемой культуральнрй среды, но обыч но она составляет от 3 до 10 дней; таким образом целевое вещество накапливается в среде по окончании культивирования„ Целевое вещество (1) можно выделить из .бульона обычным способом, применяемым для выделения антибиот ков из мицелия культивирующего бульона: целевой антибиотик содержится, в основном, в культуральном бульоне, следовательно после отделения мицелия центрифугированием ил фильтрованием целевое веществ) извл кают из фильтрата. Таким образом, целевое вещество отделяют, выделяют и очищают обычными способами, характерными в производстве антибиоти ков, например, используя разность в растворимости в соответствующем рас ворителе, разность сорбционного средства к различным сорбентам или разность в распределении между двумя жидкостями. Эти способы можно пр менять раздельно или в соответствую щей их комбинации, или повторно. Физические и химические свойства целевого соединения характеризуются следующими показателями: белый поро шок, разлагается и обесцвечивается при 160-170 0; легко растворимо в в де; ограниченнб в метаноле и плохо в других органических растворителях; амфотерное вещество с положительной ингидриновой реакцией; УФ-спектр поглощения при определении в фосфатном буферном растворе 0,01 М при рН 6,4, максимум по глощения при 273 ммк; ИК-спектр при определении в виде бромида калия поглощение при 3413, 2920, 17б5, 8 1620, 1515 и .1390 см- ; ЯМР-спектр, определенный в TMS в качестве наружного стандарта и тяжелой воде дает следующие сигналы: величина 5 (ч./млн); 2,36 (Н, мультиплет), 2,96 (2Н, мультиплет), 3,98 (ЗН,синглет),,38 (ж, мультиплет), 4,50 (ЗН, синглет), 5,59 (1Н, синглет), элементный анализ целевого вещества в наиболее чистом виде: С 37.,и k,2S, N 16,47, S 10,901; при гидролизе 6 н. соляной кислотой дает оС-аминоади пи новую кислоту, дает. 5-меркапто-1-метил-1Н-тетразол при гидролизе в метаноле Довексом 50W (тип Н, торговое наименование). Из этих данных видно, что соединение представляет собой 7-метоксицефалоспориновое соединение, поскольку оно дает сигналы при 3,98 ч./млн (ЗН, синглет, 7-OCHj) и 5,59 ч./млн (1Н, синглет, 6-СН) в ЯМР-спектре, поглощение в ИК-спектре при 1765 см (циклический лактам) и дает зС-аминоадипиновую кислоту при кислом гидролизе, кроме того, поглощение идет при 4,50 ч./млн (ЗН, синглет, тетразол-М-метил) в ЯМР-спектре; при мягком гидролизе получают 5 меркапто-1-метил-1Н-тетразол. Это соединение имеет указанную выше струк-, туру с гетероциклическим тиолом. Результаты различных хроматографических анализов и бумажного электрофореза для целевого соединения приводятся ниже. .Предлагаемая величина Rf этого соединения в тонкослойной хроматографии с помощью микрокристалической целлюлозы (авицел SF торго °® наименование), Целевое соединение 1 Цефалоспорин С 7-метоксицефалоспорин С Цефамицин С 0,26 0,26 Y-G 19 2-ДЗ Y-G 19 Z-A2 0,39 0,32 Применяют системы растворителей в следующем отношении по объему: Изопропа,ол: бутанол: уксусная кислота: 21:3:7:9 вода Бутанол:уксусная кислота: вода t: 1:2 Бутанол:уксусная кислота:вода 6:1,5:2,5 Контрольный образец - цефамицин С представляет собой 7-(5-карбоксивалерамидо)- 3 карбамоилоксиметил-7-метокс1 -цефем-|-карбоновую кислоту . V-G 19 Z-ДЗ и V-G 19 г-Д2, приме няющиеся в сравнительных опытах, являются новыми 7-метоксицефалоспор новыми соединениями, ранее выделенными из культуральной жидкости Stre tomyces oganonensls. Ниже приведена величина Rf, полу ченная бумажной разделительной хром тографией с помощью фильтровальной бумаги Ватман № 1 и смесью раствори телей бутаноя-уксусная кислота-вод в отношении 4:1:2 по объему. Величина Целевое соединение I0,39 Цефалоспорин С 0,36 7-метоксицефалосг.орин С 0,0 Цефамицин С 0,35 Y-6 19 Z-ДЗ 0,2 Y-G 19 Z-fl2 0,25 Затем соединение подвергают анал зу с помощью прибора высокоскоростной жидкостной хроматографии Хитачи (Hitachi) 635 и получают следующие результаты: колонка - мм из нержавекмдей стали; смола Хитачи 26 (катионно-обменная смола, торговое наименование); система растворителе 0,2 М цитратный буферный раствор (рН 3,6); скорость подачи-0,5мл/ скорость подачи бумаги записываюw,ero прибора 1,0 см/мин. Время задержки Целевое соединениеЦефалоспорин С 7 метоксицефалоспорин С Цефамицин С Y-G 19 Z-ДЗ Y-G 19 Z-Д2 Результат анализа на вышеуказан .ном приборе при следующих условиях приведен ниже. Колонка - |Ч Бондапак С (фирмы Вальтере Лтд) мм; система 10 растворителей - ацетонитрилгО, раствор уксусной кислоты (рН 3i3) в отношении 1:9 по объему,- скорость подачи - 0,8 мл/мин; скорость подачи бумаги записывающего прибора 1,0 см/мин. бремя задержки. (Целевое соединение 1 мин 52 с Результат полученный высоковольтным бумажным электрофорезом, следующий: фильтровальная бумага Ватман № 1; растворитель - 10%-ная уксусная кислота (рН 2,2); напряжение 2 В/см; длительность - 1 ч. Длина передвижения Целевое сое3,3 см динение Цефалоспо- . 3,5 см рин С 7-метоксице3, см фалоспорин С 3,5 см Цефамицин С 6,1 Y-G 19 Z-ДЗ 6,1 Y-G 19 2-Д2 Цистеиновая 7,5 см кислота 1,2 см Глутатион в табл.3 приводится противомикробное действие предлагаемого соединения вместе с цефалоспорином С для сравнет ния, Метод инфузионного агарового диска (раствор 500 Г/мл). Численные величины указывают диаметр (мм) зоны ингибированйяо Предлагаемое соединение можно вводить в различных лекарственных формах как таковые или в комбинациях с ДРУГИМИ лекарствами. Его можно вводить перорально, внутримышечно, внут ривенно и т.п. в виде капсул, табле ток, порошков, гранул, растворов и суспензий. Для получения препаратов можно применять различные добавкя, например манитол, сахарозу, глюкозу, . iстерилизованную дистиллированную воду, :изотонический раствор, раст1 тельное масло, например арахисовое масло, сезамовое масло. Кроме того, можно добавлять и другие ингредиенты, например стабилизаторы, связующие, противоокислители, консервирующие вещества, лубрИканты для таблеток, суспендирующие вещества, вещества, придающие вязкость, отдушки и т.п. В качестве солей соединения- применяют соли неорганических или органических оснований, которые фармакологически не являются токсичными. Доза медикамента зависит, главным образом, от состояния больного и веса больного, а также от способа введения, т.е. перорального или парентерального способа. Как правило, вводят за один раз 50 мг/кг по нессколько раз в день.

Пример 1. Получение 7-{5амино-5-карбоксивалерамидо)-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-7-метокси-Д -цефем- -карбоновой кислоты.

Культуральную среду, содержащую 1 крахмала, II глюкозы, 1,5% соево муки, 0,5 дрожжевого экстракта, 0,1% кислого.фосфата калия, 0,05% сульфата магния и 0,3% хлорида натрия, помещают в колбы Сакакучи по 100 мл в каждую и стерилизуют при 120 С в течение 20 мин. Затем кажду колбу инокулируют штаммом Streptomyces oganonensis V-G. 19 Z и культивируют kQ ч при 30°С. Кроме того, вышеуказанную культуру помещают в колбы Сакагучи на 2 л по 00 мл в каждую и после стерилизации при в течение 20 мин каждую колбу инокулируют до 2-3% бульона, полученного выше, после чего ведут культивирование течение 2k ч при 0 С для образования- инокулума.

60 л культуральной среды, содержащей 7% крахмала, 2% глютеновой муки, 2% соевой муки, 0,8% глицерина, 0,1 К1.1СЛОТЫ Казамино, 0,01% сульфата железа и 55 г едкого натра помещают в два ферментатора на 100 л вместе с 10 мл Адеканола (торговое наименование)в качестве противовспенивателя и после стерилизации в течение 30 мин при 12(f С в каждый ферментатор вносят по 800 мл инокулума, затем ведут культивирование в течение Ш ч при 30°С Затем 1-метил-5-меркапто-1Н-тетразол растворяют в водном растворе едкого натра и раствор стерилизуют под давлением и добавляют к культивируемому бульону; создав в нем концентрацию этого раствора 0,05%, зате смесь дальше культивируют 90 ч.

По окончании культивирования бульон доводят до рН 2,0 затем смешивают с Радиолитом (торговое наименование) при перемешивании. Смесь фильтруют на фильтр-прессе и полученный фильтрат соединяют и получают около 100 л фильтрата. Фильтрат доводят до рН 3,0 водным раствором едкого натра, пропускают через колонку с Амберлитом ХДП-2 (торговое наименование) на 12 л и после промывки колонки 30 л воды колонку элюируют 30 л ti 50%-ного водного раствора ацетона. Элюат упаривают до 5,5 л и концентрат доводят до рН 3,5 разбавленным раствором и пропускают через колонку с Амберлитом 1RA-68 (хлорного типа)(торговое наименование) на 3 л. Колонку промывают 6 л воды и фракционируют водным раствором (рН 7,2), содержащим

5 1 М раствор нитрата натрия и 0,1 М раствор ацетата натрия, получают около 5 л раствора, содержащего активное противомикробное вещество Раствор доводят до рН 3,0, пропускают через колонку с Амберлитом ХПД-2 (торговое наименование) на 1 л, промывают водой и элюируют 50%-ным водным раствором ацетона, получают 00 мл водного раствора,

5 содержащего активное противомикробное вещество. После лиофилизации раствора получают около 5 г сырого порошка соединения II. Сырой порошок подвергают хроматографии

0 на колонке с 800 мл смолы Сефадекс А-25 (уксусно-кислого типа)(торговое наименование) с небольшим количеством 0,5 М буферного раствора аммоний-бромида в уксусной кислоте для фракционирования активного компонента, Противомикробно активные фракции собирают, пропускают через колонку с Амберлитом ХПД-2 (торговое наименование) на 500 мл, колонку промывают водой и элюируют водным раствором ацетона. Фракции, активные против микробов, собирают и выпаривают в вакууме досуха.

Образовавшийся осадок подвергают хроматографии на колонке с микрокристаллической целлюлозой (Авицел) (торновое наименование), заполненной смешанным растворителем изопропанол: вода (7:3 по объему), применяя систему растворителей, как указано выше. Полученные активные противомикробные фракции собирают, каплями наносят на тонкослойную пластинку Авицелла SF (торговое наименование), обрабатывают системой растворителей бутанол: уксусная кислота:вода (6:1,5:2,5 по объему) и на пластинку разбрызгивают 0,25%-ный раствор нингидпин-пи.ридина, затем нагревают для вызивгг нйя окрашивания. Затем фракции с Rf 0,31 собирают. Фракции упаривают в вакууме и сушат, полученный остаток подвергают хроматографии на колочне С микрокристаллической целлюлозой (Avice)c использованием смеси растворителей - иэопропанол: бутанол:уксусная кислота:вода (объем ное отношение 21:3:.7:9). Полученные фракции, обладающие антимикробной активностью, подвергают тонкослойной хроматографии на Avicel SF (торговая марка), используя смесь растворителей того же состава, что был ука зан выше, а затем, следуя той же операции, которая описана выше, соби рают фракции с Rf 0,39 и выпаривают их в вакууме досуха. 1 Полученный при этом остаток хроматографируют на колонке с микрокристаллической целлюлозой с применением смеси растворителей бутанол.уксусная кислота: вода объем ное отношение.6:1,,5) чтобы осуществить очистку активного компо нентВо Очищенную таким образом фрак цию упаривают в вакууме досуха, рас воряют в малом количестве дистиллированной воды и разделяют на колонк с Sephadex G 10 (торговая марка) с использованием дистиллированной воды. Фракции, обладающие антимикро ной активностью, собирают и подвергают тонкослойной хроматографии с использованием смеси растворителей бутанол:уксусная кислота:вода (объемное отношение 6:1,5:2,5), как указано выше. После этого собирают фракции Rf 0,31, концентрируют, лиофилизуют и получают около 60 мг белой 7-(5-амино-5-карбоксивалерами до)-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-7-метокси-Д -цефем-(-кар оновой кислоты. Пример 2. По той же методи ке, которая использовалась в примере 1 , в данном примере, используя раствор бис(1метил-1Н-тетразол-5-ил)-дисульфид, приготовленный раст ворением последнего в воде, содержащей метанол, и стерилизованный фи льтрованием через тонкопористый (Millipore) фильтр, вместо раствора 1-метил-5-меркапто-1Н-тетразола, приготовленного растворением его в воде с использованием водного раствора гидроокиси натрия, при стерилизовании его при высоком давлении, получают 2б г неочищенного порошка 9 соединения II и, подвергая его очистке также, как и в примере 2, получают около 37 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)- 3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-7-метокси-Л -цефем-Ц-карбоновой кислоты (соединения I). Пример 3. Капсулы с сухим веществом, содержащие 120 мг 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)тиометил-А -цефем- -карбоновой кислоты, В каждой капсуле содержится. 7-(5-A wнo-5-кapбoкcивaлepaмидo)-7-мeтoкcи- 3- ( 1 -метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-А -цефем-4-карбоновая кислота Лактоза Стеарат магния Капсула № 3. 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразоя-5-ил)-тиометил-Д -цефем- -карбоновую кислоту измельчают до порошка № 60, затем лактозу и стеарат магния просеивают через тканевое сито № 60 на полученный порошок, 10 мин перемешивают все ингредиенты и заполняют этой смесью сухие желатиновые капсулы « 3. Пример k. Таблетки, содержу щие по 150 мг 7-(5-амино-5-карбокси валерамидо)-7-метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-Л -цефем- -карбоновой кислоты. Таблетки содержат, мг: 7-(5-амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси- 3-(1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-Д-цефем-+-карбоноваякислота150 Кислый фосфат кальция IP115 Стеарат магния3 Лактоза IР 39 Активный компонент смешивают с фосфатом кальция и лактозой,смесь гранулируют с 15 клейстера из кукурузного крахмала ( мг) и просеив« ют через грубое сито, сушат при tO С и снова просеивают через сито К 16, прибавляют стеарат магния и rtpeccyют в таблетки, примерно 8,5 мм в диаметре. Пример 5. Парентеральный раствор, содержащий 500 мг 7-(5-aм нo-5-кap6oкcивaлepaмидo) -у-метокси 3 {1-метил-1И-тетразол-5-ил)-тиом тил-А -цефем- -карбоновой кислоты. В каждой ампуле содержится 500 7-(5 амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-{1-метил-1Н-тетразол-5-ил)-тиометил-(5: -цефем- -кар66но вой кислситы. Активное соединение (50,0 г) при бавляют в 150 мл стерильной для инъекций воды, полученный раствор доводят до рН 8,0 с помощью разбавленного раствора гидроокиси натрия и объем раствора доводят до 200 мл Это количество раствора делят на 100 ампул, лиофилизуют и запаивают ампулы. Пример 6. Питательную среду, состоящую из % крахмала, 1°i глюкозы, 1,5 соевой муки, 0,5 экстракта дрожжей, 0,1 кислого фосфата калия и 0,05 сульфата магния, помещают в 500 мл сосуды Сакагучи в количестве ТОО мл и стерилизуют в течение 20 мин при , Затем в каждую емкость высеивают культуру Streptomyces clavuligerus IF 013307, после чего проводят культивирующую в течение 72 ч при . Далее указанную культуру в питатель .ной среде асептически переносят в с рию из 100 колб Эрленмейера емкость по 500 мл, содержащих по 50 мл раст вора, состоящего из 3 крахмала, 1,5% соевой муки, 1,5 коробочек хлопка, 0,5% цитрата натрия, 0,06 сульфата магния и 0,05 гидрата сульфата трехвалентного железа, пос ле чего культивируют при встряхивании при 27°С. По истечении часов готовят раствор 1-метил-5-мерка ,то-1Н-тетразола согласно способу, описанному в примере 1, стерилизуют этот раствор при высоком давлени и добавляют в питательную среду, доведя ее концентрацию до 0,6, после чего культивирование полученной смеси продолжают еще в. течение 1бО ч. После окончания культивирова ния питательную среду отфильтровывают способом фильтрования под давлением и получают 2,5 л фильтрата, рН фильтрата доводят до значения, равного 2,0, промывают его равным количеством этилацетата, пропускают через 50 мл колонку Дауэкс 50 В 316 (торговое обозначение), промывают в ней водой и элюируют из нее вещество 125-ю мл 0,2 М раствора фосфата натрия (рН 4,6), Элюйрованный раствор концентрируют и разделяют на колонке с микрокристаллической целлюлозой, откуда вещество элюируют смесью н-пропанол;метанол:вода (7:0,5:2,5 по объему), получая таКИМ способом водный раствор, содержащий микробиологически активный продукт. Аналогичная процедура проводится также с использованием смеси н-бутанол:уксусная кислота:вода (4:1:2 по объему). При лиофилизации раствора получают таким способом 29,5 мг порошкообразного неочищенного соединения, Неочищенное вещество очищают методом жидкостной хроматографии (хроматограф Хитачи 2160, катионная ионообменная смола, 0,2 М буферный раствор цитрата с рН 3,6, скорость потока 0,6 мл/мин, скорость движения диаграммы Т см/мин). Микробиологическая активная фракция с временем элюирования, равным 6 мин, собирается, концентрируется, после чего лиофилизуется, в результате чего получается ,9 мг (5-амино-5 карбоксивалерамидо)-7 -метокси-3-(1-метил-1Н-тетразол-1-ил)-тиометил-А-цефем-4-карбоновой кислоты, имеющей белый цвет. Аналогичные операции проделывают с использованием культур Step, rochei 12908, Strep, limpanii IFO 13306 и Strep, viridochromgenes IFO вместо культуры Strep. clavuligerus tFO 13307 и получают соответственно 28,23 и 25 мг неочищенного продукта и соответственно 3 7 и 5 мг очищенного продукта. Пример 7. Каждый из продуктов, полученных согласно опытам, растворяют в малом количестве дистиллированной воды и доводят рН раствора до значения, равного 6,0, добавяя в него гидрат окиси натрия, и лифилизируют раствор с получением оответс.твующих натриевых солей. арактеристики полученных солей, акие как цветные реакции, ИК-, УФ-, МР-спектры, показатели преломления, анные хроматографии на бумаге и жидостной хр матографии, данные по астворимости идентичны характеристиам соответствующих свободных кислот.

17

90it533

18 Таблица 1

Хорошая, желто-серая до светло-коричневой

Хорошая, светло-желтый

Хорошая, , светло-желтая до желто-коричневой

Хорошая, светло-желтокоричневая

Хорошая, светло-желтый , коричневый

Умеренная, кремовая

Хорошая, свет- Хороший, желло-желто-корич- то-серая до невый коричневоХороша, олив- Нет ково-серой до темно-оливкового

Хорошая

Сывороточная среда Лоффера

Нет

Плохой, к елтосерый

Немного, светложелтовато- серый

Очень слс1бый, светло-коричневосерый

Легкий, желтокоричневый

Очень слабый

Нет

Коричнево-серый до темно-желтогд серого

Яелто-серый до

темно-красного,

коричневый

Нет

Нет

19 О,«S-0,,55Размер спор, мк Растворимый пигмент или глицерин-аспарагиновая среда Утилизация рамнозы Отрицательная Гидролиз крахмала Сильный Коагуляция молока Положительная Слабая Пептонизация молока Продуцирование цефалоспориновых антибиотиков Положительное

SOiiSSS

20 Таблица 2 1,2-1,,8-2,0 или 0,9-1 Л сферические Желтая до зеленожелтойПоложительная Слабый Отрицательная Сильная Отрицательное 21ЭО БЗЗ22 Формула изобретения-(1метил-1Н-тетразол-5 ил)-тиометил1. Способ получения 7-(5 амино-5 ее солей со щелочными металлами фор-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3- мулы I HOOC-CH-(CH2)3-CONH-Uf -j V-lf ин где М - атом водорода или щелочного или его соли, или его дисульфидного металла,соединения формулы I 11 отличающийся тем, что,;jf-- культивируют продуцирующий 7-меток-15 jj j| 4 сицефалоспориновый антибиотик микроорганизм, принадлежащий к видуло 1-.Г Streptomyces, в культуральной среде, содержащей питательные вещества, с Способ по п,1, о т л и ч а добавлением 1-метил-1Н-тетразол-5-20 ю т и и с я тем, что используют мик-илтиола формулы I Iроорганизм Streptomyces oganonensls Ij ;jfY-G 19 2. jl i|Источники информации, НЗ принятые во внимание при экспертизе I25 1 .Патент Великобритании Bf , CHjкл. С 2 А, опублик. 1973. - -цефем- -карбоновой кислоты или ОСНз соом „