Способ получения 7-метоксицефалоспоринов или их солей с щелочными металлами Советский патент 1982 года по МПК C07D501/36 A61K31/546 C12P35/00 

1

Изобретение относится к улучшенному способу получения 7-метоксицефалоспоринов или HOod - ен - HzCiHjCioNH

где R - 5-карбоксиметилтио-1,3,4-тнадиазол-2-ИЛ-, 1,5-метил-1, 3,4-тиадиазол-2-ш1или 1,3,4-тиадаазол-2-ш1-груш1а; I М - атом водорода или щелочного металла, которые оказывают противомикробное действие, а также используются как промежуточные соединения для получения других 7-метоксицефалоспоринов с целью увеличения или изменения противомикробного спектра путем замены боковой цепи ацильиой группы в положении 7 другой ацильной группой, такой как о-аминофенилацетильная, о-карбоксифенилацетильная, о-сульфофенилацетильная, а-оксифенилацетнльная, пиридилтиоадетильная, тиадлазолнлтиоацетильная, тиазолилацетильная, дианометилткоих солей с щелочными металлами формулы 1.

odHj ,

(iH,.

СООМ

ацетильная, трифторметклтиоацетильная группа и т. д.

Известен способ получения соединений формулы I, заключающийся в том, что культивируют микроорганизм рода Streptomyces, в частности Streptomyces дг15ви5или Streptomyces lactamdurans, в культуральной среде, содержащей питательные вещества, образующуюся 7-(5-амино-5- карбоксивалерамидо)-7-метоксн-3-ацилоксиметил-З-цефем-4-карбоновую кислоту подвергают взаимодействию с гетероциклическим тиолом формулы 11

(И)

R-SH

где R имеет значения, указанные выше, и вьще394ляют яеле-вой провдхт в свободной кислоты шш ее содаз с щелош-гым металлом 1 . Недостатком нзвесглого способа является его лвтестадзйность. Цель изобретегагя - процесса. Эта цель достигается способом, которьш заключается s том, что культивкр тот микроорганизм -Streptomyces oganonensis Y-G19Z в культуральной среде, содержащей гштательные вещества, с добавлением гетероциклического гиола формульз и 5-ши его соли или его дисульфида формулы 113 R-S-S-R,(IJl) где Я имеет значения, указанные выше, и выделяют целевой прощхт в виде свободной кислоты или ее соли с щелочным металлом. Отл1Рштельяымн пpизнaкa /rи способа является то, что культивируют микроорганизм Strepxomyces oganonensis Y-G19Z в культ)ральной среде, содержащей питательные вещества, с добавлением гетеро1шклического тиола формулы 11 HjBi его соли, или его дисульфвда форр.1улы 111. Таким образом, предлагаемый способ позволяет по.пучить соединения 1 в оллу стадию ферментации, без проведения дополнительной химической реакции путем добавления гетероциклического тиола 11 его производных к культ ральной среде во вре.мя культиващи. Streptomyces oganonensis Y-G19Z является новым штаммом, который был выделен из почвы в Огайо-Тауне, Хихибугун, префектура Саитама, Япония. Этот иламм сдан на хранение в институт микробиологической промышленности, агенство промышленных наук и технологии Ми1шстерства международной торговли Японии под № F ER М-Р2725,. а также в американскую коллекцию типовых культур, 12301 Парклоун Драйв Роквилл, Мериленд 20852, США, под номером АТСС 31167. Микологические свойства этого штамма. 1. Морфологические характеристики штамма S.oganonensJs Y-G19Z. Он растет как в природной, так-и в искусственной среде с образованием хорошо разветвленного субстратного мицелия, в то время как образование воздушного мицелия недостаточно и поэтому образование спор плохое. Цепи спор прямые, относятся к тнпу R (Rectus) или RF (Rectiflexibtles), в каждой цепи по 10--SO спор. Спорь эллиптические, сферические или цилиндрические по форме, размер 0,45-0,60 X 0,55-0,90 мкм Поверхность спор гладкая. Не наблюдаются флагеллатные и спорангиевые споры, 2. Культуральные характерисгики штамма S oganohensis приведены в таблице.

Иеоргаштческяе

согтКрахмальн;1:й

aiap

ТКООЗХНОБЫЙ

fleT

Плохой

желто-серый

iilMIKIO. CBCTJIOЬелныи

жеI г(1в:1 fhifi.

СО Mil 794 Лучше применять соли, которые растворяются в воде, и вести погружное культивирование в жидкой культуре. Можно применять любую культуральную ср ду, содержащую питательные вещества для штамма S.oganonensis Y-G19Z. Можно применять искусственную культуральную среду, полуискус ственную и природную, содержащую питательные вещества. В качестве источника углерода в ней можно применять глюкозу, сахарозу, манитол, глицерин, декстрин, крахмал, растительшле масла и др. В качестве источника азота можно применять мясной экстракт, пептон, глютеновую муку, муку из хлопковьис семян, соевую, арахисовую , кук фуэную муку сухие дрожжи, дрожжевой экстракт, сульфат йммония, мочевину и другие органические и неорганические источники азота. В культуральную среду при необходимости можно такж добавлять металлические соли, например сульфаты, нитраты, хчориды, карбонаты, фосфаты и т. п. натрия, калия, магния, кальция, вднка и железа , При необходимости в культуральную среду можно также добавлять вещества, облегчающие образование антибиотиков, или противовспенивающие агенты, например метионин, щтстемн, цистин, метилолеат, лярд, сили коновое масло, поверхностно-активные веществ и т. п. Вышеуказанные гетероциклические тиолы формулы И или их соли, и;га дисульфидньге соединения формулы 111 обычно добавляют в ко1щеятрации 0,1-5 мг/мл, л чтле 0,5 - 2 мг/мл. HOod.- сн-ciHjdHgCjHgCioNit-l-г -, Аддитивное соединение. 5-Меркапто-1,3,4-таадугазол-.2-тиоуксусная кислота ЛИ Физические и химические свойства целевого соединешля 1 еле .дующие. Белый порошок. Начргнает плавиться при 156-160°С и становится корич1- евым и разлага ется при 170°С. Легко растворимо в воде, уме ренно растворимо в метаноле и плохо растворимо в дрчтих органических растворителях ; Амфотерное вещество с положительной нингидриновой реакцией. Дает ультрафиолетовый спектр поглощения; при определеншг в фосфат

do он. Их можно добавлять в культуральную сред) за один раз перед культивированием или порциями в начальной стадии культивирования. Обычно желательно вести культивирование в аэробных условиях, температура культивирова ния обычно составляет 18.-35, 30°С. Кроме того, желаемые результаты получают, если рН культуральной среды составляет 5--10, лучше 6-8. Длительность культивирова1 ия зависит от состава и температуры применяемой культуральной среды, но обычно она составляет 3-10 дн., таким образом, целевое вещество накапливается в среде по окончании культивирова шя. Целевой антибиотик по изобретению содерж тся в основном в культуральном бульоне, следовательно, после отделения .мицелия центрифугированием или фильтровадаем целевое вещество извлекают из фильтрата. Таким образом, целевое вещество отдел5 ют, выделяют и очищают, например используя разность в растворимости в соответствующем растворителе, разность сорбционного средства к различным сорбентам или разность в распределении между даумя жидкостями. Эти способы можно применять раздельно или в соответствующей их комбинации, или их применять повторно. Физические и химические свойства соединений по изобретению следуюгщ{е. 7- (5-Амино -5-карбоксивалерамид)-3- (5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиa ц aзoл-2-ил)-тнov;eтил-7-м-гтoкcи- Д -иефсм-4-карбоиовая кис:;1о:а . ном буферном растворе 0,01 М с pEi 6,4 /:,а.:т лмксимум поглощения при 287 ммк. Дает инфракрасный спектр поглощения при определении в виде таблетки из бромчла кал:-;. дает поглощение при 3413, 2929, 1736. 1620. 1515 и 1380 см- Даст следующие сигналы при ЯМР-спектре, при определе ти в TMS как наружном ста)шартб в тяжелой воде; величины tf (ч./млн): 2,35 (4М, мзльтиплет, 2,96 (2И, мульп плет); 4,00 (3ii, синлет), 3,73-4,33(2Н, квартет, D 18 Гц); . 4,25 {IH, мультиплетк 4,44 (2Н. синглет); 4,42-4,91 (2Н, квартет, J 4 Гц); 5,63 ПН; синглет). Целевое вещество, пол 1екног в г{аибо.т)С1 чистом виде, имеет следующий элеме1парнь1:л состав, %: С 35,95; Н 3,8; М 10.85; S i8J3.

994829210

При гидролизе 6 н. соляной кислотой даетацетилирования его и превращения продукта

а - аминов дипинов у ю кислоту.в метиловый эфир дает следующий фрагмент

Масс-спектр этого соединения после N - хлор с м/е 392 Из вышеприведенных фактов видно, что это соединение является 7-метоксицефалоспорином, поскольку оно дает поглощение при 1763 (циклический лактам) в инфракрасном спектре поглощения, наличие сигналов в ЯМР спектре при 4,00 ч/млн. (ЗН, синглет, 7-ОСНз), 5,63 ч. мпн..(1Н, синглет, 6-СН), 3,73 4,33 (2Н, квартет 3-18 Гц, 2-СН2) и 4,42 4,91 (2Н, квартет, 3 14 Гц, 3 боковые цепи CHj), соединение дает а-аминоадипиновую НООС Аддитивное соединение ITTf

н JL JL dH,

Физические и химические свойства целевого соединения 11.

Легкий желтовато-зеленый порошок. Нет определенной температуры плавления, окрашивается в коричневый цвет и разлагается при 170° С. Легко растворимо в воде, слабо растворимо в метаноле и нерастворимо в органических растворителях. Аморфное вешество с положительной нингидриновой реакцией.

Ультрафиолетовый спектр поглошения. определяют в фосфатное буферном растворе 0,01 М с рН 6,4, максимум поглошения при 272 ммк.

Инфракрасный спектр поглошения определяют на таблетках из KB, поглощение при 3420, 2930, 1765, 1610, 1515 и 1385 .

ЯМР спектр, определенный в TMS в качестве наружного стандарта в тяжелой воде дает следуюшие сигналы: 0(ч/млн) : 2,34 (4Н, мультиплет), 2,95 (2Н, мультиплет), 3,19 (ЗН, синглет), 3,72-4,31 (2Н, квартет, 3 18 Гц), 3,99 (ЗН, синглет), 4,26 (1Н, мультаплет), 4,40-4,95 (2Н, квартет, 3 14 Гц), 5,63 (1Н, синглет).

Элементарный анализ целевого соединения, полученного в самом чистом виде,%: С 37,82; Н 4,01; N 12,90; S 14,97.

При гидролизе 6 н. соляной кислотой дает а-аминоадипиновую кислоту, а при гидролизе в метаноле Довексом 50 W (водородного типа, торговое название) дает 2-меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазол.

Из этих данных видно, что соединение представляет собой 7-метоксицефалоспорин, поскольку оно дает поглошение при 1765 (циклический .лактам) в инфракрасном спектре поглощения, сигналы при 3,99 ч/млн (ЗН, сииглет, 7-ОСНз), 5,63 ч/млн (1Н, синглет, 6-СН), 3,72-4,31 ч/млн (2Н, квартет, D 18 Гц, 2-СН2), 4,40-4,95 (2Н, квартет, 3 14 Гц, 3 боковых цепи CHj), дает а -аминоадипиновую кислоту при кислотном гидролизе, в ЯМР спектре имеется поглощение при 3,19 ч/млн (ЗН, синглет, тиадиазол С-СНз), при мягком гидролизе получают 2 -меркапто-5-метил-,3-4-тнадиазол, т.е. это соединение имеет вышеуказанное строение с гетероциклическим тиолом.

7-(5-Амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метокси-3-(1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометил- Д-цефем-4-карбоновая кислота с н-С{НгС1Н2С1Нг(1онн:4-f Нг кислоту при кислотном гидролизе, кроме того, из того факта, что соединение дает поглощение при 4,44 ч/млн (2Н, синглет, CHi-S-CHj-COOH) в ЯМР и дает фрагмент при м/е 392 в массспектре производного, видно,.что соединение имеет вышеуказанное строение с гетероциклическим тиолом. 7-(5-Амино-5-карбоксивалерамидо)-7-метоокси-3- (5-метил- 1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометнл- Д -цефем-4-карбоновая кислота ОбНз .з А -l JLciH; dooK

(iH-dHgdHj dHg do H-j-Y -

КНг Адпитивкое соединение 2-меркапто-1,3,4тиадиазолъг-К ..-.J Физические и xи дичecкиe свойства целевого соединения 111 следующие. Легкий желто-белый порошок. Нет определенной температуры плавлетая, окрашивается в коричневый цвет и разлагается при 175-180 С. Легко растворяется в воде, слабо растворимо в метяноле, нерастворимо в други органических растворите.оях. Амфотерное вещество с положительной нингидриновой реак цией. Дает ультрафиолетовый спектр поглощения при онределегаш в фосфатном буферном растворе 0,01М с рН 6,4. максил ум при 274 мл/гк Дает инфракрасный спектр поглощения при О 1ределе1ши в виде таблеток KB поглощение при 3400, 2925, 1765, 1610, 3515 и 1365 см Спектр магнитного резонанса, определенный а TMS в качестве внешнего стандарта в тяжелой воде дает следующие сигналы: величина 6 (ч/млн): 2,30 (4Н, мул&птлет), 2,93 (2Н, мульткплет), 3,69-4,29 (2Н, квартет, 3 18 Гц), 3,97 (ЗН, сштлет), 4,26 (Ш, мульткгшет), ,4,45-4,99 (2Н, квартет, D 14 Гц), 5,56 (1Н, синглег), 9,85 (Ш, синглет). Элементарный целевого вещества, полученного в наиболее чистом виде. %. С 37,53; Н 4,36; N 12,77; S 16,42. При гидролизе 6 и. соляной кислотой дает и аминоадигшновуга кислоту, а при пвдрол -5зе в метаноле Довексо Л 50 VV (водородного типа, торговое наименование) дает 2- мерк апто-1,3,4- тиадиазо.п. Исходя из всех да}шых ясно, что соед11не шв является 7-метоксицефалоспорином, поскольку оно дает поглощение 1765 в ик фракрасиом спектре поглощет1я, сигналы при 3,97 ч/гг4лн (ЗН, синглет, 7-ОСНз), 5,56 ч/млк (Ш, синглет, 6-СН), 3,69-4,29 ч/млн (2Н, квартет, 3 18 Гц), 4,45-4,49 (2Н, квартет, 3 - 14 Гц, 3 боковых цепи CHj), «аминоадкгшновую кисло}у при ккслогаом гид ро:шзе, кроме того, из того факта, что погло щенке идет при 9,85 ч/млн (1Н, сннтлет, гиазол СН) S ЯМР к мягкий пшрояиз дает 2меркапто-1,3,-1- тиадиазол, решено, тго сосдине1Ш

ОСН ,

J-i

0 Т

боон о изобретению имеет вышеуказанное строение гетероциклическим тиолом. Результаты различных хроматографическнх нализов и бумажного электрофореза для елевых соединений 1, 11 к 111 по изобретеию приводятся ниже. Величины R зтих соединений в тонкослойой хроматографии с помощью микрокристалической целлюлозы (Авицел SF, торговое наименование) следующие. Соединение123 10,39 , 0,37 0,32 И0,430,43 0.40 111 .0,390,38 0,33 Цефалоспорин С0,370,36 0,31 -Метоксицефало- спорин С0,410,360,32 Цефамищш С0,370,360,31 У-С19г-ДЗ0,26.0,260,22 У-С19г-Д20,390,32 0,26 Применяют следуюище системы растворителей, об объему: Изопропанол-бутанол-уксусная кислотавода 21:3:7:9 Бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:2 Бутанол-уксусная кислота-вода 6:1, 5:2,5 Контрольный образец (цефамицин С) представляет собой 7-(5-карбоксивалерамид)-3-карбамоилесиметил- /-метокси- й. -цефем-4карбоновую кислоту. У-СШг-ДЗ и У-С19г--Д2, применяющиеся в сравнительных опытах, являются новыми. 7-метоксицефалоспориновыми соединениял-ш, ранее выделенными из культуральной жидкости Streptomyces oganonensis. Ниже пр1геедены величины Rt, получен:ные бyJмaжнoй разделительной хроматографией с помощью фильтровальной бумаги Ватман № 1 и смесью растворителей бутанол-уксусная кислота-вода 4:1:2 по объему. СоединениеВеличина R 10,40 Цефалоспорин С0,36 7- Меток сицеф алоспорин С0,40 Цефамицин С0,35 У-С19г-ДЗ0,24 У-С19г-Д20,25 Затем ведут анализс помощью прибора скоростной жидкостной хроматографии Хита си 635 и получают следующие результаты. Колон ка 3x500 мм из нержавеющей стали; смола Хитаси 2610 (катионо-обменная смола, торго вое наименоБание). Система растворителей 0,2 М цитратный буферный растрор (рН 3,6) скорость подачи 0,6 мл/мин; скорость подачи бумаги записывающего прибора 1,0 см/мин. Время задержк Соединение 1 5 мин 33 с 9 мин 35 с 5 мин 18 с Цефалоспорин С 7- Метоксицефалоспорин С 5 мин 09 с Цефамицин С 5 мин 18 с У-С19г-ДЗ 3 мин 42 с 3 мин 42 с Y G19Z-fl2 Результаты анализов на указанном прибор при других условиях следующие. Колонка мк Бондапак Cig (фирмы Вальтере Лтд) 4x300 мм. Система растворителей ацетонитрил -0,1% раствор уксусной кислоты (рН 3,3), 1:9 по объему. Скорость подачи 0,8 мл/мин. Скорость подачи бумаги записывающего прибора 1,0 см/мин. Соединение Время задержк 3 мин 14 с 1 2 мин 55 с 1 мин 56 с Результаты, полученные высоковольтным бумажным злектрофорезом, фильтровальная бумага Ватман № 1. Растворитель 10%-ная уксусная кислота (рН-2,2). Напряжение 42 В/см. Длительност 1ч. Соединение. Длина передвижения, см I3,6 II3,6 III3,9 Цефалоспорин С3,5 7-Метоксицефалоспорин С Цефамицин С -С192-ДЗ У-С19г-Д2 Цистенновая кислота Глутатион Далее приводится противомикробное дей ствие соединений 1, 11 и 111 по изобрет нию вместе с цефалоспорином С для сравнен (Метод инфузионного агарового диска (раствор 500 /мп), численные вешгины указывают д метр, мм, зоны ингибирования). I IIIII Цефал спори Sarcina lutea АТСС 9341 Staphylococcus aureus 209 Р Bacillus: subtil is АТСС 6633 Escherichia coli 19,2 14,2 13.0 NIHJ Klebsiella pneu- 21,8 23,0 23,0 Salmonella galli- narum24,0 23,5 Proteus vul- garis OX 1922,6 20,0 Proteus mira22,2 19,5 23,0 bilis IMF OM-9 Каждое из соединений 1,11,111 по изобретению можно вводить в различных лекарственных формах как таковые или в комбинат ях с другими лекарствами. Соединения по изобретению можно вводить перорально, внутримышечно, внутривенно и т. п. в виде капсул, таблеток, порошков, гранул, растворов и суспензий. Для получения препаратов применяют различные добавки, например манитол, сахарозу, глюкозу, стерилизованную дистиллированную воду, изотонический раствор, растительное масло, например арахисовое, сезамовое. Кроме того, можно добавлять и другие ингредиенты, например стабилизаторы, связующие, противоокислители, консервирующие вещества, лубриканты для таблеток, суспендирующие вещества, вещества, придающее вязкость, отдушки и т.п. в качестве солей соещшений приме1{Я1от соли неорганических или органических оснований, которые фармакологически не являются токсичными. Дозы медикаментов зависят, главным образом, от состояния больного н его веса, а также от способа рведения, т, е. перорального или парентерального. Как правило, вводят за один раз 50 мг/кг по несколько раз в день. Пример 1. Пол)чекие 7-(5-амико-5-карбоксивалерамидо) -3- (5-карбо.ср{метилг;.о-1,3,4-тиадиазол-2-ил)-тиометнл-7-метокси- Л -цефем-4-карбоновой кислоты 1. Культуральную среду, содержащую,%; крахмал 1,0; глюкоза 1; соевая 1,5; дрожжевой зкстракт 0,5; кислый фосфат калия 0,1; сульфат магния 0,05 и хлористый натрий 0,3, помещают в колбы Сакагучи на 500 мл по 100 мл среды и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин. Затем каждый образец инокул руют штаммом Y-G19Z Streptomyces oganonensis и культивируют в течение 48 ч при . Культуральную среду помещают в колбы Сакагучи на 2000 мл по 400 мл в кажЩТо, стерилизуют 20 мин при 120° С и икокулируют

1594

указанным выше штаммом с концешрацией 23%, а затем культивируют 24 ч при 30° С для обеспечетгя дал посева.

60 л кул&турапъной ср,цы, содержащей,%: крахмал 7; глютоновая мука. 2; соевая 2: гликерш 0,8, кислота Казал-ишо ОД; С)льфат железа 0,0 и едкий натр 55 г загружают поровну в два ферментатора на 100 л вместе с 10 шт Адеканола (торговое наименоваш е). в качестве пеногасителя, затем стерилизуют 30 л-гин при 120° С и в каждый ферментатор вносят по SOO мл ;культуры для посева, а затем культтшируют при 30 С в течение 24 ч. В водлом растворе едкого натрия растворяют 5мерк-апто-1,3,4-тиадиазол-2-тиоук;сусную кислоту и раствор стер}1лиз}1ст под давлением и добавлякп 3 ка;к,дый фермбнтатор до 0,05% нно-. кул1/ма н К;пы таиру от еще 90 ч.

Г1о оконча 1ки культ1широва щя рН бульона поводят до 2,0, затем бульон смеишвагат с

Рэлиолитом (торговое наимеповашге). Смесь ф-,льтру1от с погч-гощьа фильтр-пресса, фильтраты соединяют и полутют около 100 л фильтрата. Фильтрат доводят до рН 3,0 с помощью воллого раствора едкого натрия, пропускают через KOjtoHKy с Амберяитом ХА,Д-2 (торговое ьгазванпе) на 12 л и колонку промьгвают 30 п нодь, затем злюяружт 30 л водного SO/r-Horo ацетона. Злюат выпаривают до объема 5,5 л и после удаления примесей до5звля:ют воду до общего объема 10 л.

Полтекный таким образом раствор дово7дят .ijo рН 3,5 рйзбгшлсш-той водой соляной кислото затем пропускЕшт через колонку с Амберлитом 1 RA-68 (шп.з хлора, торговое наиме1 оваь ие) ;й 3 п. После промывки колонки 6 л вош-ii, /глю.грование ведут водным раствором (рИ 7.2J сопержащигл 1М нитрата натрия и 0,1М апетэта начрия, пол}Г-1ают около 5 л раствора, содержащего прогиБомккробяое акт.чвное вещество. рН раслвора доводят ,п,о 3,0 , пропускаю го через колонку с А.мберлитом ХАД-2 (торговое название) и после промывкй колонки водой ее элюйрзтот BOJUibTM раствором 50%-ного адетонн Е по-л т-шют около 400 мл водного раствора, содержащего протнвомнкробное вещество. Лиофигшзацией этого раствора поя чают около 18 г сьфо.го поропжа указанного соедннешля

Saref.i 18 г сырого порошка подвергают хорматографировапию на колонке с помопдью 800 мл смолы ДЕ.ЛЕ-Сефадекс А--25 (типа.ксуской кислоты, торговое наиг генозаяие) с небольшим количеством 0,5 iM буферного растзра бромида аммония в уксусной кислоте и фрак-БГонируит нужные компоненты, Получснаые противопШкробные фракьдаи собирают,

пропускают через колонку с 500 мл Амберлкт ХАП-2 (торговое i-raHMCiJOBaHife) и после прокьшкя колонки водой колонку элюируют

водным раствором адеюна н элюат выпаривают досзха.

Затем, применяя систему растворителей изопропанол:вода (7:3 по объему), остаток продукта подвергают хроматографнрованию на колонке с микрокристаллической деллюлозой (Авидел) с помощью такой же систе.мы растворителей как указана выще. Фракш(ю с иротиволмкробным действием н каплями наносят на тонкослоЙ1гую пластинку Авидел SF (торговое название), обработат) системой изопропанол: бутанол: уксусная кислота; вода (2):3:7;9 по объему), затем на нее набрызгивают пиридиновый раствор 0,25% нишидрина и по.аогревают до окрашивания. Затем собирают фракцию с R 0,39. Эту фракцию вьпиривают в вакууме досуха при 45-50 С и хроматографируют на колонке с микрокристаллической деллюлозой (Авидел), обработанной системой растворителей изоп ропапол: бутаиол: уксусная к ислота: в ода (21:3;7:9 по объему). Полученную таким образом противомикробную фракпию подвергают тонкослойной хроматографии на Авидел систе.мой растворителей, как у|сазано выше, и по такой же методике, фрак1ши с Rr 0,39 собирают и выпаривают в вакууме досуха. Остаток тфодукта снова очищают хроматог-рафией на колонке с микрокристаллической целлюлозой с помощью системы растворителей бутапол:уксусная кислота;вода (6:1,5:2,5 по объему). Очищенную активную фракдию выпаривают досуха н растворяют в небольпюм объеме ялстиллирсг ва1шой воды. Раствор обрабатывают ча колонке Сефадекс G-10 (торговое наименоварше) с помощью дистиллированной воды. Фракши, показавпше противомикробпое действие, собирают и Ёюдвергают тонкослойной хроматографии, как указа1 о выше, с при.менение.л системы растворителей бутанол :уксусная кислота:вода (6:1,5:2,5 по объему). Фракции, показавише R г- 0,32, собирают, выпаривают и лиофилизуют гопучают около 80 мг чистой 7-(5-амипо-5-карбоксивалерамидо) -3- (5-карбоксиметил-1,3,4-тиа,: казол-2-и;1)-тиометил-7-метокси- Л -дефем-4-карбоновой кис;ють.

П р ;1 hl е п 2. Получение 7 - (5-aминo-5-кapбoкcивaлepиa.vидc)-7-мeтoкcи-3- (5-метил1,3,4- .игл.иазол-2-нл/тиомегил- Д пефе.м-4 карбоковой кислоты 111.

Кул.ыуральную среду, содержащую, крахft-ил 1; глюкоза 1; .мука соевых бобов 1,5; ::1кстракт дрожжей 0,5: кислотофосфорнокиспыл калий 0,1; сульфат магния 0,05 и шористьпл натрий 0,3 поме.щают в 500 мл колбы Сакгуш по 100 мл в каждую и 20 мин стери.ггизуioT при 120 С. Зате. на каждой среде про13водят посев штамма У-G19Z Streptomvces oganonensis культинир ют при 30° С в тсчегше 48 ч. Другую культ ральн -10 сре.чу. как опи17948сано выше, помещают в 2 литровые колбы Сакагучи по 400 мл в каждую и стерилизуют при 120° С в течение 20 мин. На каждой среде производится посев бульонной культуры, полученнои по описанию, с концентрацией, равной 2-3%, и затем культивируют при 30° С в течение 24 ч с целью получения культуры для посева. Отдельно в два 100-литровых ферментатора вместе с 10 мл Adecanol (торговая марка, пено |гаситель), загружают по 60 л культуральной среды, содержащей,% крахмал 7; тонко размолотая клейковина 2; мука соевых бобов 2; глицерин 0,8; кислота Казамино 0,1; сульфат железа 0,01 и гидроокись натрия 55 г, стерилизуют при 120С в течение 30 мин, засевают 800 мл посевной культуры и культивируют при 30° С в течение 24 ч. После зтого растворяют 2-меркапто-5 метил-1,3,4-тиадиазол в водном растворе гидроокиси натрия, стерилизуют при высоком давлении и прибавляют его в бульонкую культуру так, чтобы концентрация получе ного раствора в бульоне стала 0,05 %, а затем культивируют в течение 90 ч. По окончании культивирования бульон доводят до рН 2,0 и при перемешивании прибав ляют Radiolite (торговая марка). Смесь филь руют с помощью фильтр-пресса, фильтраты соединяют и получают около 100 л раствора. Фильтрат доводят до рН 3,0 с помощью водного раствора гидроокиси натрия, пропуск ют через колонку с 12 л Амберлита XAD-2 (торговая марка), промывают колонну 30 л зоды и элюируют 30 л 50 -ного водного рас вора ацетона. Элюат концентрируют до объем 5,5 л и доводят его рН до 3,5 с помощью разбавленного водного раствора соляной кислоты, затем снова пропускают через колонну с 3 л Амберлита IRA-68 (С1-тип, торговая марка). Колонну промывают 6 л воды и элюируют водным раствором (рН 7,2) , содержащим 1 М нитрата натрия и 0,1 М аде-, тата натрия и получают раствор объемом около 5 л антимикробноактивного вещества. Этот раствор доводят до рН 3,0, пропускают через колонку с одним литром Амберлита XAD-2 (торговая марка) и после промывания колонны водой элюируют 509г-нь м водным раствором ацетона, получают 400 мл водного раствора антимикробноактивного вещества. Продукт лиофилизугот. Используя смесь растворителей бутанол: .уксусная кислота вода (4:1:2 по объему), полученный остаток подвергают хроматографии в колонне с микрокристаллической целлюлозой Avicel (торговая марка) и указанной выше смесью растворителей. Затем антимикроб юактивнь1С фракции разделяются и на тонкослойной пластине Avicel SF (торговая марк 18 с помощью смеси растворителей изопрюпанол: бутанол: уксусная кислота: вода (объемное отнощение 21:3:7:9) и пиридинового раствора 0,25% нингидрина, которым обрызгивают хроматограмму с последующим нагреванием для получения окраски. Таким образом, собирают фракцию, имеющую R f 0,43, выпаривают досуха в вакууме при 45-50° С и хроматографнруют в колонне с лмкрокристаллической целлюлозой Avice 1, применяя смесь растворителей ацетонитрил: вода (объемное отношение 7:3). Полученная фракция антнмикробноактивного препарата подвергается тонкослойной хроматографии на Avicel SF (торговая марка), как указано выше, после чего собираются фракции, имеющие R 0,43, и выпариваются досуха так, что получается 0,78 г неочищенного порошка. Этот порошок растворяют в небольшом количестве воды и подвергают разделению иа колонне с Sephadex G 10 (торговая марка), используя дистиллированную воду. Фракции с антимикробной активностью отделяют и подвергают тонкослойной хроматографии с применением смеси растворителей бутанол:уксусная кислота: в ода (объемное отношение 4:1:2V. как было указано выше, а фракции с R { 0,43 собирают, концентрируют, лиофилизуют и получают 32 мг белого вещества - 7-(5-амино-5-карбоксивалераш1до) -7-мeтoкcи-3(5-мeтил-I,3,4-тиaдиaзoл-2-ил)-тиoмeткл- Д -цефем-4-карбоновую кислоту. Пример 3. По той же методике, которую используют в примере 1, получают намеченное соедр:нение 1 - около 45 мг 7- (5-ами Ю-5-карбоксивалерамидо) -3- (5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил/тиометил-7-метоксиД -цефем-4-карбоновой кислоты, применяя раствор бис- (5-карбоксиметклтио-1,3,4-тнадиазол-2-ил) дисульфида, полученный растворением последнего в воде, содержащей метанол, и стерилизованный путем фильтрования его через тонкопористый (Millipore) фильтр, вместо раствора 5меркапто-1,3,4-тиадиазол-2-тиоуксусной кислоты в воде, для чего пользуются водным растворюм гидроокиси натрия, а стерилизуют при высоком давлении. Получено 23 г неочищенного порошка намеченного соединения 1, который затем очищают по методике, приведенной для очистки продукта в примере 1. Пример 4. По методике примера 2, используют раствор бис-(5-метил-1,3,4-тиадиазол2-ил)дисульфида, приготовленный раствор)ением дисульфида в воде, содержащей метанол, и стерилизуют его фильтрованием через тонкопористый фильтр (Milljpore), вместо раствора 2меркапто-5-метил-1,3,4-тиадиазола, приготовленного с использованием в качестве растворителя водного раствора гидроокиси натрия и стерилизёванного при- высоком давле1ши, получают околс :9 i иэощпцеяного пороисса соеш-гнегкя n а после о-Идстки его по методу, прийёде5гаому S примере 2, йотгучают около 50 мг 7- (5-ашг ка 5- КЕ:рбокс 1ва.11сралдадо) - 7- ме гокск- 3- (5- метил -1,3.4-т;;ад/шэол-2-нл)тяо - етил- Д -цефем-Фкар боповой кислоты соединение 11). П п м м ер 5. Получение 7-(5-EЛ.ffiиo-S кaтiбoкcraзaлepaMi дo)-7-мeтoкcи-3- (ЬЗ -тиадйаггол- 2-ил) тиометил- U -цефем-4-кяр6оново; кислоты III). Ку1гьг;,ралыгуго среду, содержащую,%: крахмал 1: глшхоэз 1; лука соевых бобов 1,5; экстракт дрэ;,Жсй 0,5; кислый фосфорггокисл;,й кал1П1 ОД; сульфат магния 0.05 и хлорис натрий 0,3 помещакт в колбы Сакагуп-; елгкосгоЮ 500 мл по 300 мл ц каждую, л1йую1 при 120° С в теэдняе 20 мин и производят посев ;итамма У-G19Z StreptcrnycBS o-y-3r:on-snsis после кулыкввруют при 30 С Б течение ля и. Другую часть той же культура i04 средьг тюмешают i; две 2-литровьге колб-CaKarj-iffi по 400 MJ; я каждую. стер -лизуют при в течск.;е 20 мин к затем ироизво.оят посеп с помощью полученной по описяяному ЛЮто.ду бульонной кулътурь; так, чтобы ее ко ис;{трп;;ия оанкялась 2--3%, культивирую ри 3 течение 24 ч для получения купьт р...; д.;;Я посева. Отде.пьнс для 100-.1ттропь х ферментатор г.мосте с 100 д/зу, Adecpnol (торговая марка, пелогаокто.;;- загружают 60 п кулыурзльной среды, содер/кя ией, хиахмал 7; тонко раз--1Спотая клейковина 2; ..iyca cccEhsx бобоп bn{j )л посевко;- культуры и кз льиширу :от .. ;0С С L; теченне 24 ч. После этохо го::-с к; растзср 2--мерк2пто-J .3,4.,г- ад;7пзола путйл.. оас;всрягс-:я тг.:адч;азсла водс, яспол эу ; тлл vorD 1од1гь Й раст:;ор п-дроокк :я ;;aipij;i. .уя;дей сгерйлйЗй1 :ве5 этогэ ррствора лфт KbvroK.::; ;та;;Л1;н:;--.ч п (Трм6ав. ;о.и/И-т тЬ:« тя;:ут;.-;р - буЛЬО1Ш:: С куЛЬТу у ГИК, ЧТСОл KCKU T;:;;J: -:K тиадягзола с;яла равной 0.05% прсцтохмл злтем кульпгвкрованне о Тсчсгс/с ..С 0K. П ;lHИИ КУЛЬСКВМРС Вй -П-ЕЯ доЕсдлт до рН 2,0 к г еремеш гоаш и прл бщляют R.3diolits (торговая марка). Снес.ь фьшыруюг на фяльф-прессе, фи(.1тьтра-1ы соедгтiuao- и полуламт около г, раст араФкльграт доводят по рИ /уО, гфопускзггт чероз к-:гюняу с 12-л /ичберлзгта XAD-2 (тс;,г,Еая ), проныкгют у;оло1шу 30 /; 0%лого годного рйствора ацетоиЕ, Элю,3 x:owiefrT КОЛОШ-п с ирсмыванп 6 ) воды и элюируют водным раствором (рИ 7,2), содержащим 1 М гштрата натрия к П,1 М ацетата натрия, , таким образом. 5 л раствора, содержащего а1гти ликробоактивный материал. Раствор доводят до pi .3,0, пропускают через колонну с 1 л 4мберлита .KAD -2 (торговал марка), промывают водой и элюируют 5Ш(--ным водным раствором аде1она, получая в р1езультате около 400 мл водноЕт.) растБОра, содержащего антимикробо-э,кткв.ный материал. Этот раствор лиофилизуки. Используя с,месь растворителей бутанол:уксусная кисло:а:15ода (объе.мное отно1Це ие 4:1:2). получе}1нь Й остаток подвергягот хроматографии га соло} не с микрокристаллической целлюлозой (joproEjan марка Av/icsl), обработа.ню.ч указанной аып.е смесью раствори гелей. .Лнтимикробоактивные (}5ракш-1и разделяют на го гкослойиой 11ластк} е Avice (торговая марка), причем для проявления используют смесь раствоухчтелей изо1 ропа1-:ол;н-буганол; уксуслап кислг)т:1:вода (обье.мное отнопгеиие 2 :3:7:9), опрыскивание 0,25Д-ным раствором i-MHiH.npHiia в г .1 ридиие и narpCiiuiKiC- Фракмии с R г 0.39 со 5ирают, Б П ар1-;пают в вакууме при 45-50G. Остаток пг одукта хроглг.тографируют Е колоьке с мик|)окрисгаллической целлюло:юй (Avicel). обра5о- :1ииой смес),.10 растворителей анетонитр л:вода (о6ьем}ое отноипие 7:3), Фракш1и, облада С ;ие антимикробной акгибиостыо, подвергают тонкослойной хрот;лто1рафц,- г:а .Avi - cl SF, как указ,:;чо вмтпе, ii те фра:-,гшн, которых R 0.39 . лосуха вь-паpi-n :iriT в вакууме, i результа;е чете : пл} 1азот 0,92 г псочи деииого порошка. Песлчшеитый лорошок раствс:1т пот в малом количестве о стиллироваяной водь л кроматографяруют с помощью Лмберлита CG -50 Ui-T.4u) и ВОЛЬ, собирагот а тими; ;робоактивъ:с фракдии, конденгрируют их и л-АофАпир,-т-;г Остаток 1:1астцоряют в малом количестве ,;к:;тиллирог зн ЮЙ воды и разделяют пз колонке с Зоопс пех G |0 (торговая марка) с примсиеrKCivi .нстиллнровалюй воды. После проверки 1:нтч 1И;сроПкт1Й экткв1 ОСга каждой фракции отбираю; а;ттиврые фракдаи и ношертают их толкосло;:; ой хроматографии с Л 1И гепен1;ем MJCi рас-зор ттелей бутэнол:киело-1а:вола (об1,,е отнои еш)е 4:1:2} согласно описанчаи ivieToziHKe. Зате.ч собира.чтт (|5ракции R, 0.3 ксИ1-с:гтрнруг1-т их, лиофили:)ук)т и 1;о;:у ают ,-i мт белого BensecTria, лред7тя} Л ю;;ито cooTi; --(5-ами ;о.-5-карПоксивалерамидо) 7-ме-)ксг-3 (1.3,4-тиг;у а:ол- 3-;-;л I -;-fo:v-e 1Ил-i,;C(pe;-4-Krt :i5o OBy o кисл(.лу. 1; р и м е р 6. Кяяс1п Й чз ч;Х1;:-,ктов, :;огласио 1.2 и . paciBtv и ;м,1:юл: количестве диг:i-rii p(H;i;ni;i

воды и доводят рН раствора, раствор с получением соответствующих натриевых солей.

Характеристики полученных солей такие как цветные реакции, ИК-, УФ-, ЯМР-спектры, показатели преломления, данные хроматографии на бумаге и жидкостной хроматографии, данен -CHidHz HtdONH- f

NHj

где R - 5-карбоксиметилтио-1,3,4-тиадиазол-2-ил, 5-метил-1,3,4-тиадиазол-2-ш1 нли 1-3,4тиадиазол-2-ил;

М -водород или щелочной металл, путем культивирования микроорганизма рода Strep tomyces в культуральной среде, содержащей питательные вещества, с выделением целевого продукта в виде свободной кислоты или ее соли с щелочным металлом, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве микроорганизма рода Streptomyces используют Streptomyces oganonensis

ные по растворимости идентичны характеристикам соответствующих свободных кислот.

Формула изобретения Способ получения 7-метоксицефалоспоринов

или их солей с щелочными металлами общей

формулы

odH,.

.. 2- dooM

Y-G19Z и культивирование ведут с добавлением гетероциклического тиола общей формулы

R - SH,

где R имеет указанные значения, или его соли, или его дисульфида общей формулы

R-S-S-R , где R имеет указанные значения .

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Великобритании № 1321412, кл. С 2 А, опублик. 1973 (прютотип)