Способ получения сульфата октапептидамида-терминального октапетида холецистокининпанкреазимина Советский патент 1979 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 C07K1/00 C07K1/113 

октапептидамида используют соединения формулы II. JiC-ASp-Tar-Met-Gly-Trp-mi-A9p-PheM уFOPW где X - трет-бутилоксикарбонильная, о6,ос.-диметил- (3,5-диметокси) -бензильмая группа, у - трет-бутилоксигруппа, W - гидроксильная группа, For - формильная группа, в качестве сульфирующего агента используют комплекс третичного амина, содержащего по крайней мере одну алкильную группу и трехокись серы, процесс проводят в диоксане с последующей отработкой полученного сульфа та гидроокисью щелочного металла и последующим удалением оставшихся защитных групп ацидолизом. Предпочтительными вариантами, являются использование комплекса-третичного амина с трехокнсьюсеры в 20 30-кратном избь1тке, использование в качестве комплекса комплексного соединения - N-метилморфолина с трехокисью серы, проведение ацидолиэа динатриевой соли сульфата октапептид а;мид обработк 6й последнего смесью из 70-85% трифторуксусной кислоты, 5-10% меркаптоэтанола, 5-10% воды и 5-10% анизола или меркаптоэтанолсул фокислот.ой, растворимой в ледянойук сусной кислоте. Осуществление сульфирования октапептидамида формулы II в указанных условиях позволяет получить сульфат окта пептидамида формулы Г с выходом 77%. Исходный защищенный октапептид (формулы IT) получают постепенным .наращиванием пептидной цепи конденсацией аминокислотных фрагментов с использованием известных методов пептидной химии, например, азидного карбодиимидного, метода активирован ных эфиров и т.п. 3. Не участвующи в реакции функциональные группы защи щают известными защитными группами, которые после проведения реакции могут быть легко отщеплены гидролиз ацидолизом или другими известными м тодами, селективно или одновременно Азот индола триптофановой молекулы защищают фррмильной группой, поскап куэТа группа при проводимом во вре синтеза молекулы пептида ацидолизе препятствует образованию нежелатель ных производных третичного бутила. Защищенный октапептидамид формулы II обрабатывают раствором комплек са N-метилморфолина и трехокиси серы (взятом в 20-30-кратном избытке) в диоксане или в смеси диоксана в дим тилформамиде. Комплекс получают в р зультате реакции обмена между клорсульфоновой кислотой и N-метилморфолином 4. 834 Полученный зацщщенный сульфат октапептидамида переводят в натриевую соль с помощью водного раствора 2 м эквивалентного едкого натра, затем защитные группы трет-булгилоксикарбонила и: трет-бутилокси группу удаляют, обрабатывая смесью 70-85 об.% трифторкислоты, 5-10 об.% маркаптоэтанола, 5-10 об.% воды и 5-10 об.% анизола или 3 м раствором меркаптоэтансульфокислоты в ледяной уксусной кислоте. Получают целевой сульфат октапептидамида. Если требуется дополнительная очистка, продукт затем хроматографией на колонке с силиг кагелем с применением для элюирования смеси равных частей этилацетата и смеси пиридина, уксусной кислоты и воды в отношении 20:6:11. Получаемый согласно изобретению с высокой чистотой и с высоким выходом октапептидамидсульфатный эфир формулы I по своим характерным физикохимическим свойствам и фармакологическим действиям идентичен с продуктом, полученным по известным методам. При дозах 2-10 мг/кг, при внутривенном применении на собаках, это соединение вызывает значительное сокращение желчного пузыря и расслабление сфинктера Одди. Продукт можно применять как для диагностики, так и для терапии . Температуру длавления соединений определяют в аппарате Тоттоли. Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках из силикагеля (силикагель по Шталю) в следующих системах растворителей:этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:6:11)1:1 (1); этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:6:11) 6: 4. (2); этилацетат-(пиридин-уксусная кислота-вода 20:6:11) (3). Пример 1. L-Аспарагил-О-сульфат -Ь-тирозил-Ь-мети онилглицил -L-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид. 1,6 мл (25 ммоль) хлорсульфоновой кислоты растворяют в 2 мл хлороформа и смешивают при при слабом перемешивании с раствором из 3,3 мл (30 ммоль) N-метилморфолина в смеси из 3 мл диоксана и 3 мл диметилформамида. К образованной суспензии через 5 мин добавляют раствор из 1,25 г (1,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонил- -трет-бутиласпарагил-L-тирозил-L-мeтиoнилглицил-N-фopмил-L-тpиriтoфил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланиламида в 8 мл диметилформамида. Смесь перемешивают при комнатной температуре 3 ч, затем охлаждают до при перемешивании, добавляют 5 мл 4 и.едкого натра. Раствор упаривают досуха, остаток растирают с 20 мл оклажденной до воды, нерастворимый прЪдукт отфильтровывают, дважды промыВают водой (каждый раз 20 мл), затем один раз 20 мл эфира. Полученный сырой защищенный октапептидамидсульфатный эфир растворяют затем в смеси из 25 мл метанола и 25 мл воды и величину рН раствора поддерживают, добавив 2 мл 4 н. едкого натра, около 8.,Через 20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью 1:1 ацетона и эфира, отфильтровывают и промывают эфиром. Полученный продукт растворяют в охлажденной до сме.си из 8 мл трифторуксусной кислоты, 1 мл воды, 1 мл анизола и 1 мл меркаптоэтанола, раствор выдерживают 3 ч при 15-20с и затем при перемешивании вливают в 100 мл эфира. Получают 0,90 г Ь-аспарагил-О-сульфат-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Ьг-триптофилметионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамида (77% от теоретичес-U кого); R .f, (1) 0,4. В случае необходимости конечный продукт чистят с помощью хроматографии на колонке, содерл ащей 80 г силикагеля, в качестве растворителя применяют смесь этилацетата, пиридина, ледяной уксусной кислоты и воды в соотношении 37:20: :б:11.

Применяемый в качестве исходного вещества трет-бутилоксикарбонил- -трет-бутил-L-аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метонил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидполучают следующим образом:

Д. N-трет-бутилоксикарбонил-N -формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-ь-фенилаланинамид.

22,34 г (50 ммоль) Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгидрохлорида растворяют в 200 мл диметилформамида, смешивают с 11,1 мл (100 ммоль) N-метилморфолина и 23,9 (50 ммоЛь) N-трет-бутилоксикарбонил-Ы-формил-Ь-триптофанпентахлорфенилового эфира. Величину рН раствора регулируют добавкой остального N-метилморфолина до 7-7,5. Через 12 ч реакционную смесь упаривают до 50 мл и при интенсивном перемешивании вливают в охлажденную до-0°С смесь из 200 мл 5%-ного раствора гидросульфата калия и 100 мл не содержащего перекиси эфира. Осажденный продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 26 г чистого третбутилоксикарбонилтетрапептидамида(72% от теоретического) ; т .пл. -22( в диметилформамиде); Ц(..

Б. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицинпентахлорфениловый эфир.

1,9 г (6,2 ммоль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицина и. 1,92 г (7,2 ммоль) пентахлорфенола растворяют в 31 мл диметиЛформамида. Смесь охлаждают до 0°С, по каплям при перемешивании к ней добавляют раствор 1,41 г (6,85 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 6,2 мл диметилформамида и продолжают перемешивать при той же температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь выдерживают ночь при комнатной температуре, затем выпавшую в осадок дициклогексилмочевину удаляют фильтрованием и фильтрат упаривают при пониженном давлении. Остаток растирают с , фильтруют, промывают небольшим количеством эфира и перекристаллизовывают из 15-кратного

количества этанола. Получают 2,19 г трет-бутилоксикарбонил-Ь-метионилглицинпентахлорфенилового эфира (63,6% от теоретического); т.пл. 1б9-171°С; R 0,8- (хлороформ-метанол 8:2).

.В. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-метиоп НИЛГЛИЦИЛ-N-формил-Ь-гриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид.

25,3 г .(35 ммоль) N-трет-бутил оксикарбонил-М -формилтриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидарастворяют в 120 мл раствора 1 н. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Через 90 мин Раствор упгфивают до половины объема и, добавив 500 мл

эфира, осаждают тетрапептидамидгидрохлорид. Полученную соль отфильтровывают, промывают, эфиром и сушат. Получают 20,3 г Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгидрохлорида (88% от теоретического) ; т.пл. 207-209°С.

3,3 г (5 ммоль) указанного.тетрапептидамидгидрохлорида и 2,77 г

(5 ммоль) трет-бутилоксикаРбонил-L- .

-метионилглицинпентахлорфенилового эфира растворяют в 25 мл диметилформамида и смешивают с 1,11 мл (10 ) N-метилморфолина. Спустя 24 ч реакционную смесь упаривают в

вакууме до половины объема, остаток . вливают при перемешивании в смесь из 50 мл 5%-ного раствора гидросульфата калия и 30 мл эфира. Осадок отфильтровывают, промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 г трет-бутих1оксикарбонил-Ь-метионил-Ь-глицил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамида(81% от теоретического); т.пл.175П9°С; Rf (3) 0,45.

Г. трет-Бутилоксикарбонил-Ь-тирозил-Ь-метионил-Ь-глицил-Ы-формил-L-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамид.

3,65 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбрнил-Ь-метионилглицил-Ы -формил-Ь-хриптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-L-фенилаланиламида растворяют в; 15 мл раствора 1 н. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Через

30 мин гексапептидамидгидрохлррид осаждают добавкой 30G мл эфирй, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат.. Получают 3,2 г L-метионилглицил-Ы-формил-Ь-триптофил-Ъ-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинамидгид7рохлорида (94% от теоретического); т.плЛЗО-132 с, 3,2 г СЗ,11 ммоль) указанного гек сапептидамидгидрохлорида и 1,84 г (4 ммоль) трет-бутилоксикарбонил Ь-тирозин-2,4,5-трихлорфенилового эфи ра растворяют в 25 мл диметилформамида и смешивают с 0,9 мл (8 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь выдерживают в течение 24 ч, затем упаривают до половины объема и остаток выливают при перемешивании в смесь из 50 мл 5%-ного раствора гидросульфата калия и 30 мл эфира, Осадок отфильтровывают, промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,7 г трет-бутилоксикарВрнил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил к формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенклаланинамида (92% от теоретического); R (3)0,55 Д, трет-Бутилоксйкарбонил-р-трет-бутил-Ь-аспарагил-Ь-тирозил-Ь метионилглицил-N-формил-Ь триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил Ь-фенилаланинамид. 3,7 г (3,45 млюль) трет-бутилоксикарбонил-Ь-тирозил-Ь-метионилглициЛ-N формил- Ь-триптофил-Ь метионил -Ь-аспарагил-Ь-фенилаланинаг.шда растворяют в 15 мл раствора 1 и. соляной кислоты в ледяной уксусной кислоте. Через 30 мин, добавив 30 мл эфира, осаждают а ептапептидамидгидрохлорид, отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Получают 3f45 г Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Ы-формил -Ь-триптофил-Ь-метионил Ь аспарагил -L-фенилаланинамидгидрохлорида (99% от теоретического), 3,04 г (3,0 мг.толь) полученного .: указанным способом гептапептидамидгидрохлорида и 1,7 г (3,17 ммольЯ пентахлорфенилового эфира трет- бутил оксикарбонил- 5-трет-бут11:ласпарагино вой кислоты растворяют з 20 мл диме. тилформамида и смешивают с О,7 мл (6,3 ммоль) метилморфолина. Реакцио ную смесь выдерживают в течение 24 зате{л при перемешивании вливает в смесь из 50 мл раствора гид росульфата калия и 30 мл эфира. Оса док отфильтровываютр промывают водой, затем эфиром и сушат. Получают 3,01 г трет-бутилоксикарбоиил-р-тре -б тил-Ь-аспарагил-Ь-тирозил Ь-мети нилглицил-N.-формил--Ь-триптофил-Ь-мети онил-Ь.-аспарагилфен ил аланин ами (80% от теоретического); R . (3)0р7 Пр и м е р 2. L- cпapaгил-0 cyл фат-Ь-тирозил-Ь метионилглицил-Ь тр тофил-Ь метнонил-.Ь-аспарагил 1| фени аланинамид. ,2,1 МП (32 мг-толь) хлорсульфоново кислоты растворяют в 2,1 мл хлорофо ма и при при интенсивном пере мещивании сманивают с раствором 5,2 (47 ммоль) N-метилморфолинав смеси 22 мл диоксана с 5,2 ып диметилформ 3 мида. К полученной суспензии добавляют раствор 1,05 г (1,0 ммоль) оС ,0 -диметил- (3, 5 диметокси) -бензилоксикар бонил-|Ь-трет-бутил-Ь--аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-Н-формил-L-типотофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаламинамида в 5 мл диметилформамида. Раствор перемешивают 3 ч при комнатной температуре, затем выливают в 100 МП безводного эфира. При охлаждении в ледяной бане (0°С) из раствора выпадает осадок. Величину рН суспензии доводят до 3 с помощью 4М раствора едкого натра. Защищенный октапептидамидсульфат-сложный эфир отфильтровывшот, пpOIvlывaют небольшим количеством охлажденной воды, сушат. Полученный защищенный оЬтапептидамидсульфат-сложный эфир растворяют в смеси 3 мл диметилформамида и 10 мл этанола и рН среды доводят до 8 посредством от 4 М раствора едкого натра. Спустя 20 мин раствор упаривают, остаток растирают со смесью ацетона с эфиром 1:1, отфильтровывают и лромывают эфиром. Защитную группу удаляют по.способу, описанному в примере 1. Получают 0,90 г продукта (77-% от теоретического); R (1)0,4 Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, заполненной силикагелем. Исходный IX,оС-ДИметил ( 3,5-диметокси)-бензилоксикарбонил-р трет-бутил Ь-аспарагил-Ь-тйрозил-Ь-метионилглицил-N -формил-L-триптофил-L-метионил Ь-аспарагил-ь-фенилаланинамидполучают следующим образом, К раствору 0,5 г (1,3 ммоль) об ,«;-диметил-3,5-диметоксибензилоксикарбонил-трет-бутилоксиаспарагиновойкислоты и 0,37 г (1,4 ммоль) пентахлорфенола в 8 мл этилацетата при добавляют раствор 0,29 г (1,4 ммоль) дициклогексакарбодиимида в 5 мл диметилформамида. Раствор перемешивают 1 ч при 0°С и оставляют на ночь при коьшатной температуре. Выделившийся дициклогексилфррмамид отфильтровывают и зтилацетат отгоняют при уменьшенном давлении. Раствор 1,09 г (1,0 ммоль) гептапептидамидгидрохлорида (полученного как указано в примере 1Д) в 10 мл диметилформамида добавляют к раствору полученного активного сложного эфира в диметилформамиде и к смеси добавляют 0,22 мл Ы-метилморфолина. Реакционную смесь оставляют на 24 ч, затем выливают в смесь 25 мл 5%-ного раствора кислого сульфата калия и 20 мл эфира. Осадок отфильтровывают, промывают водой, эфиром и высушивают, Получалот 1,05 г защищенного октапептидаЬИда (85% от теоретического); Ri (3)-0,7. Пример 3, Исходяиз 1,25 г (1,0 ммоль) Tplef-бутилоксикарбонил-В-трет-бутил-Ъ-аспарагил-Ь-тирозил-Ь-метионилглицил-ы-формил-Ь-триптофил-Ь-метионил-Ь-аспарагил-Ь-фенилаланйиамида получают октапептидамн зсульфат-сложный эфир по способу, описанному в примере 1. Полученный продукт растворяют при комнатной температуре в 10 МП уксусной кислоты, содержащей 3 моля меркаптоэтансульфокислоты, раствор оставляют на 10 мин затем вьшивают в 100 мл эфира. Выпавший в осадок продукт отфильтровывают, промывают 2 порциями эфира по 20 мл и высушивают. Получают

L- Sp-L-Tyr-L-het-L-Gly-L-Trp-L-Met-L-ASp-L-PlrelJH (i)

SOjE

путем взаимодействия защищенного октапептидамида с сульфирующим агентом в растворителе с последуюгдам снятием запретных групп и вьщелёнием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и повышения выхода целевого продукта, в качестве защищенного октапептидамида используют соединение формулы Ц

X-ASp-Tyr-Met-G-ty-Trp-Met-Asp-Phe-NHГаг

W

где X - трет-бутилоксикарбонильная, Л,й,-диметил-(3,5-диметокси)-бензильная группа,

у - трет-бутилоксигруппа, W - гидроксильная группа, For - формильная группа, в качестве сульфирующего агента используют комплекс третичного аьшна содержащего по крайней мере одну, алкильную группу, и трехокись серы, процесс проводят в эфире с последующей обработкой полученного сульфата гидроокисью щелочного металла и последующим удалением оставшихся Защитных групп адидолизом.,

2. Срособ по П.1, о т л и ч а. ю-. щи и с я тем, что комплекс, образованный ИЗ третичного амина с трехOKJUCfyKi серы, применяют в 20-30..-кратном избытгке.

3; Способ по п,1, отлича ю- щ и и с я . тем, что в качестве компекса амин-трехокись серы применяют комплексное соединение N-метилморфоина и трехокиси серы и в качестве эфира-диоксан.

4.Способ по П.1, отличающийся тем, что в качестве гидроокиси щелочного металла используют гидрат окиси натрия,

5,Способ поп,1, отличающий с я тем, что ацидолиз осуществляют смесью из 70-85% трифторуксусной кислоты, 5-10% ёркаптоэтанола, 5-10% воды и 5-10% анизола или раствором меркаптоэтансульфокислоты в ледяной уксусной кислоте.

Источники информации, принятые во 35 внимание при экспертизе:

1. Патент ФРГ 1922185, кл, С 07 С 103/52, 1975.

2.M.A.Ondett; ,J.P.PEueSe5,E.F.5abo, XT.5heehau, N.WUEiams,synthesis oi oho40 BecyBtokinin-pancreozimin I,Tlie C-terminuB dodecoipeptioii,iI.Am.Chem.5oc.. i970, 92,c.195.

3, Шредер Э., любке К.Пептиды,

Мир

4,1, 1967, с,116,

M,,

45

4.P.Baumgarten,lJber eine Methods zur euBfonierund ordanischen Lind anor.don eche stoffefBenfchte, 1926,59,0.19767 310 0,9 г октапептидамидсулъфата (77% .от теоретического) R (1)0,4. Продукт может быть очищен хроматографированием на колонке, содержащей 80 г силикагепя по способу, описанному в примере 1. Формула изобретения 1.Способ получения сульфата октапептидамида - терминального октапептида холецистокининпанкреазимина формулы