Штамм термофильной бактерии нэнг 6108-продуцент -амилазы Советский патент 1979 года по МПК C12K1/02 

Изобретение oiносится к микробиологической иро.м1,.1е11 1()сти. точнее, к получению hOBOio нггамма термофильной бактерии Baeillns (iiasla ncns НЭМГ 6-108, исиоль3ve i()ro д.1и образования фермента а-а.милазы, например, Р, производстве спирта разжижения .чма.1исто1о cyc;ia и в текстп.чьпой нро 11 п 1;1ен11ост;| д;1я ;)ас1плихтовки TKaHeii.

ИзвестШ) шзличные liiia.MMbi термо()ильной бактерии Baeillus ciiastaticns. псно.1ьзуе.мой д,ля об|)азования фермента а-амплазы И, 2|.

Извест1П 1е Н1Т-;1М,п имеют невысокхюаа.милазпую активность, что не нозво.чяет пптенеифипироват) iipoHecihi разжижеп11Я кра.хма;1истого сусла и рас1н„1п.то1гку тканей.

Целью П31.б|41си;)| является получение нового ппа,)м;; .ч; cioiiKiiMH биохимическими свойетва.п;. o6.ia.;aion,ero в.ысокой способностью к биос П1тезу а-амилазы и. тем самым, к пптенс1 ф1:.-ч;:чии иропесса разжпжения крахмалистого сусла и увеличению вы.хода cinipiti.

т(,1ьной бактерии Вас. diastatiens ИЗНГ МОВ - продуцент а.милазы выделен двукратно10 воздействия мутагенами; новэмби.хипом на первой ступени селекции и нитрозогуанидппом без при.менения м таген1н 1х факторов - на второй стунепи селекции.

Штамм термофильной бактерии Bacillus diastaticn НЭНГ 6-108 - продуцент а-амилазы хранится в Институте микробиологии Aкaдe iИli наук СССР.

Л орфолог11чеекие признаки.

На картофельно-пептонном агаре и на синтетической агаризовапной среде в присутствии тиамина, пара-амнпобензойной кис,, биотина, а,1анина, фени,1аланпна и метиоиипа при 48-час культуры образуют палочковидные к,четки, соединенные в це(ючки из трех п более клеток. Размеры клегок (5,0 6,0) X (0,6--0,8) мк: Спорообразование слабое, споры цилиндрические размером 1,5 X 0,8 мк.

Рост на жидких средах. На картофельно-пептонном бу,1ьоне при 60°С через 24 час появляется хлоньевидньп осадок, который через трп-шесть дней значительно увеличиБается. Без взба,птыванпя среда прозрачная. На синтетической среде с мальтозой через 24 час образуется нежный осадок, на пятыеHiecTbie сутки па повер.хности среды образуется тонкая пленка, осадок значительно увеличивается.

Рост на твердых средах. При посеве штрихом на картофельно-пептонном агаре рост интенсивный, плоский, светлый, бежевый, слабо блестящий, край волнистый, поверхность мел-14Озернистая. На синтетической среде рост такой же, но менее интенсивный.

При посеве уколом на картофельно-пептонном агаре на поверхности рост интенсивный, плоский, светлый, бежевый, слабо блесТЯШ.ИЙ; по уколу рост слабый, воронкообразный, с разрывом среды. На синтетической агаризованной среде рост на поверхности средний, по уколу - - очень слабый с небольшим разрывом среды.

Гигантская колонии через 65 час роста на картофельно-пептонном агаре округлая, плоская, светлая, бежевая, центр колонии более плотный, чем края, края колонии фестончатые, поверхность мелко-зернистая. Диа.метр колонии 15-17 мм. На сиьгтетической агаризованной среде колония такая же, но диаметр ее равен 10-12 мм.

Физиологические признаки.

Штам.м гидролизует К1)ахмал, редуцирует нитраты в нитриты, молоко не свертывает, казеин гидролизует слабо, же.чатину не разжижает. Выдерживает концентрацию x;ioристого натрия до 3,(/о па картофельно-пеитонном бульоне.

Отношение к источникам уг.1ерода.

Штамм утилизирует с образованием кислот: глюкозу, фруктозу, маннозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, мальтозу, сахарозу, неллобиозу, рафинозу, крахмал; хуже утилизирует лактозу, не утилизирует целлюлозу. Использует в качестве источников углерода маннит, хуже - сорбит, очень слабо-ину.:1ия. органические кислоты.

Отношение к источ1п-1кам азота.

Штамм асси.милирует пептон, мочевину, аммонийные соли неорганических кислот, некоторые аминокислоты, в частности асиарагиновую и глутаминовую кислоты, ва.чин, гистидин, изолейцин, метионин, орнитин, серии, фенилаланин, цистеин. Нитраты использует гораздо хуже.

Штамм термофильной бактерии Bacillus diastaticus НЕНГ 6-108 испытан в лабораторных условиях.

Для глубинного культивирования н:тамма была применепа среда следующего состава, вес. °/о: пептон - 0,3; мальтоза - 0,7; Nn NO3--0,l; NaCl 0,05; CaCl2 - 0,01; MgSO4 - 0,01; Na2HPO4 - 0,01; MnCb 0,005; СаСОз - 0,1; тиамин, пара-амииобензойная кислота в концентрации 2 .мг/л; биотин - 0,3 мг/л; аланин, фенилалании и метионин - по 3 мг/л (DL-форма).

Выращивание проведено в колбах на качалке при 240 об/мин. Максимальное накопление а-амилазы в культуральной жидкости наблюдали к 16 час роста щтамма.

си-амилазную активность определяли иодометрическим методом, разработанным во Всесоюзном научно-исследовательско.м институте продуктов брожения.

Разжижающую способность определяли на вискозиметре Оствальда, используя в качестве субстрата 1°/с1-ный нерастворимый крахмал, время гидролиза 10 мин, при 75°С.

При разведении культуральной жидкости штамма в 350-400 раз иаблюдали падение вязкости нерастворимого 1°/о-ного крахмала на 83/о, а у исходной культуры такое же падепие вязкости крахмала - только при разведепии ее в 100 раз

Таки.м образом 1овый ппамм обладает разж1 жаюп.ей способностью в 3,5-4,0 раза больп1ей, чем исходпая культура в тех же условиях.

.Активность нового 1итамма составляет 46---60 ед/.мк моль/мл-мин. и в 1,7- 2,2 раза вьиие, чем у исходной культу зы на аналогичг:ой среде.

П))и этом П1тамм Bacillus diastaticus lIF.nr 6-108 сох)аияет вькчжую t-амилазi i() иктивиость, примерно, 1,5 |-ода, т.е. является стабильным по (jcHOBHi)iM биохимическим с1И}йст ам и 11)едста.1яет собой штамм со стойки.ми мор(1ологическими, культу|1альными и (}п1;,и()о.;киическими свойства.ш, заключающимися в Н(ии п11енной способности к биосинтезу а-ами.лазы.

Формула изобретения

Штамм тер.мо())и.льчой бактерзп- Bacillus ciiasta ticus Hin J t)-l()8 |родуцеит (-ами,1азы хранится в Ипс1итуте микробиологии .ЛН СССР.

Морфологические признак - штамма: на картофельно-пептонном aiape и на синтетической ага)изоваиной среде в присутствии тиамииа, нара-аминобензойпой кислоты, биотина, а;1аиина, фснилаланииа и метионина при 60°С 48-час ку.льтуры образуют па;10чков)1Д1Ц5|е к.летки, соедн 1е1-п 1 1е в цеиочки из трех и более к;геток. Ра:5меры клеток (5,0-6,0) X (0,6--0,8) мк. Спорообразование с,laбое, споры цилиндрические размером 1,5Х X 0,8 мк.

Рост на жидких средах. На картофельно-пентонном бульоне нри 60°С через 24 час появляется хлоньевидный осадоК. который через три-и1есть дней значительно увеличи-вается. Без взбалтьщания среда прозрачная. На синтетической среде с мальтозой че)ез 24 час образуется РШЖЩЯЙ осадок, на пятыеniecTbie сутки на поверхности среды образуется т( п;1еика, осадок значительно уве.чичивается.

Рост на твердых средах. При посеве штрихом на картофельно-пеитонно.м агаре рост интенсивный, нлоский, светлый, бежевый, слабо блестящий, край волнистый, поверхность ме;1козерниетая. На синтетической среде рост такой же, но менее интенсивный.

При посеве уколом на картофельно-пептонпом агаре на гюверхноети рост интенсивный, плоский, светлый, бежевый, слабо блесгяи1,ий, но уколу рост слабь т, воронкообразный, с разрывом среды. На синтетической агаризованной среде рост на поверхности средний, но уколу - очень слабый с небольшим разрывом среды.

Гигантская колония через 65 час роста на карто(|)ельно-нентонном агаре округлая, плоская, светлая, бежевая, центр колонии 6o.iee n.iOTHbHi, чем края; края колонии фестончатые, поверхность мелкозернистая. Диаметр колонии 15 --17 мм. На синтетической а|-аризова1П1ой среде колония такая же, но диаметр ее равен 10-12 мм.

Физнолоические признаки. Штамм гидролизует крахмал, редуцирует нитраты в нит(:1ИТ1)1, мо.юкс; не свертывает, казеин гидролпзует c;ia6(;, /келатину не разжижает. Выдерживает конпентрапию хлористого натрия до 3.() на ка)И)(|)ельно-нентонном бу.тьоне.

С)тнон1еиие к источникам углерода. Штамм утилизирует с образованием кислот:

глюкозу, фруктозу, .маннозу, галактозу, ксилозу, арабинозу, мальтоЗу, сахарозу, целлобиозу, рафинозу, крахмал; хуже утилизирует лактозх, не утилизирует целлюлозу. Использует в качестве источников углерода маннит, хуже - сорбит, очень слабо - инулин, органические кислоты.

Отношение к источникам азота. Штамм ассимилирует пептон, мочевину, аммонийные соли неорганических кислот, некоторые аминокислоты, в частности аспарагиновую и глутаминов ю кислоты, валин, гистидин, изолейцин, метионин, орнитин, серин, феннлаланин, ццстеин. Нитраты исцо,яьзует гораздо хуже.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

;. Ими1енецкий .. А., Солнцева Л. И., Броцкая С. 3. Препарат амилазы термофильных бактерий (сунердиалаза), - «Текстильная г|ромьпн,тенность, 1943, 11, с, 11.

2. Авторское свидетельство СССР .NO 372257, кл. С 12 В 3/02, 1973,