Штамм 203-продуцент нейтральной протеиназы Советский патент 1980 года по МПК C12N15/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частнос ти, к получению нового штамма, селек тивно синтезирующего нейтральную про теиназу. Известен штамм Bacillus subtil is - продуцент внеклеточных фермен тов, имекяций следующие морфологические и физиологические признаки: клет ки палочковидные размерами 1,5-2,7 мкм X 0,3-0,5 мкм, обычно не соединен ные в цепочки. Палочки подвижные с помощью перитриховых жгутиков, грамположительные, окрашены однообразно, темных форм нет, без капсул, как пра .вило эксцентральные, реже - расположенные в центре. Споры имеют размер 0,9-1,3 мкм 0,5-0,7 мкм, форму цилиндрическую или эллипсоидальную, прорастают экваториально путем разрыва мембраны вдоль экватора. На мясо-пептонном агаре 24-часовая культура образует колонии диаметром 3-4 мм. Колонии беловатые, непрозрачные, тусклые, шероховатые, экстенсивные, складчатые в центральной части, края гладкие. Аэроб. Оптимешьная температура роста 36-37°С при рН 6,6-7,0. Гидролиэует крахмал, пептонизирует мо2|-.:-::-;,v,; локо, разжижает желатину. Усваиваёг сахарозу, глюкозу и 1/3 сорбита с образованием кислоты, без вьщеления j газа. Не усваивает лактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, рамнозу, маннит, дульций, инозит. Нитратов не восстанавливает до нитритов. Не растет на среде с цитратами 1. Однако он синтезирует смесь ферментов - нейтральную и щелочную протеииазу, oL -амилазу, а также образует споры, что приводит к загрязнению внешней среды. Наиболее близким к изобретению является штают Bacillus subtMis WB 746, продуцирующий нейтральную протеиназу со следующими характерными признаками: клетки подвижные, образующие шероховатые колонии. Величина клеток 2,5-3 мкм «0,5-0,7 мкм, трансфбрмабильный . Свежие колонии белые, после 48 ч инкубации темнеют и становятся коричневьили 2. Однако зтот штамм не обладает достаточной протеолитической активностью. Целью изобретения является получение нового высокоактивного штамма Bacillus subtil is, селективно синтезирующего нейтральную протеиназу.

Обладающего повышенной протеолитической активностью и большей интенсивностью размножения.

Для получения штамма BacMlus subtil Is 203 исходный штамм Bacillus subtil is we обработалц нитроJгyaнидинoм и бактерии высевали на: 1тлотную среду сицайзена, имеющую Ы объема обезжиренного молока. Были отобраны колонии, образующие зоны гидролиза казеина. Исходный штамм на такой среде зон не образует, . Полученный штамм Bacillus subtilis 203 - продуцент нейтральной протеиназы хранится в музее культур микроорганизмов ВНИИгенетика. Коллекционный номер ЦМПМ Б-1714.

Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, средние размеры 0,6-0,8 мкмх2,7-3 мкм, подвижные , грамположительные, находятся отдельно или в виде небольших цепочек 2-4 клетки, окрашены однообразно, темных форм нет, без капсул. Является аспорогенным,

Культуральные признаки. На мясопептонном агаре образует ровные белые колонии, цвет колоний не меняется и при длительной инкубации. Колонии легко суспендируются в жидкости. Диаметр колонии и односуточной культуры на мясо-пептонном агаре 2-3 NBVI.

Физиологические признаки.Лэроб, аспорогенный., на споруляционной .среде образует меньше 0,1% терморезистентных спор. Максимальная скорость роста при 37-39°с. Расщепляет казеин, пептонизирует гжэлоко, не расщепляет крахмал. Хорошо усваивает и растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, ацетате, цитрате. Слабо растет на манните, не растет на сорбите и лактозе.

Культура хранится в пробирках на мясо-пептонном агаре под вазелином, а также в лиофилизированном виде.

Для определения активности стерильную питательную среду СМ-12 засевают штаммом Bacillus subtilis 203, после чего инкубируют культуру при 37 С на качалке при 80 об/мин.После 24 ч роста в культурной жидкости определяют активность по расщеплению азоказеина. За единицу брали активность фермента, необходимую для расщепления 1 мг азоказеина в течение 60 мин при .

В табл.1 приведены сравнительные данные активности внеклеточных ферментов предлагаемого штамма Bacillus subtilis 203 и исходного Bacillus subti1i s WB 746.

Из табл.1 видно, что предлагаемому штамму характерно практически полное отсутствие синтеза щелочной протеиназы и i -амилазы, однако силь-) но повышен синтез нейтральной протеиназы - 150 раз.

Пример. Получение ферментного препарата из мутанта Bacillus subt i1i s 203 .

Культуру выращивают в течение 24 ч в синтетической минеральной среде, к центрифугату (1,5 л) культуральной жидкости добавляют 3 объема ацетона, охлажденного до(-10 fc. Образовавшийся осадок центрифугируют и лиофилъно высушивают, полученный 0 сухой ферментный препарат растворяют в 0,05 М трис-HCl, рН 7,5, содержащем 0,01 М CaClg . Исследовали действие ингибиторов: ЭДТА-фенантропина,фенилметан-сульфофторида (ФМСФ). Определяли протеолитическую и амилолитическую активность.

В табл.2 приведены удельные активности центрифугата и ферментного препарата.

Из результатов следует, что в ферментном препарате, а также в центифугате наблюдается высокая активность метаило (нейтральной) протеиназы.Активности сериновой (щелочной) проте иназы практически отсутствуют.

Таблица 1

0,12 52,5

3,5

0,35

0,1 формула изобретения Штамм Bacillus subtills 203 продуцент нейтральной протеиназы хранится в музее культур микроорганизмов внИИгенетика. Коллекционный номер ЦМПМ Б-1714. Морфологические признаки. Клетки прямые, палочковидные, средние размеры 0,6-0,8 мкмх2,7-3 мкм, подвижные, грамположительные, находятся отдельно или в виде небольших цепоче 2-4 клетки, окрашены однообразно, темных форм нет, без капсул. Является аспорогенньм. Культуральные признаки. На мясопептонном агаре образует ровные белые колонии, цвет колоний не юняeтся и при длительной инкубации. Колонии легко суспендируются в жидкости. Диаметр колонии односуточной культуры на мясо-пептонном агаре 2-3 м

{Таблица 2 Физиологические признаки. Аэроб, аспорогенный, на споруляционной среде образует меньше 0,1% терморезистентных спор. Максимальная скорость роста при 37-39 0. Расщепляет казеин, пептонизирует молоко, не расщепляет крахмала. Хорошо усваивает и растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, ацетате, цитрате, слабо растет на манните, не растет на сорбите, лактозе. Культура хранится в пробирках на мясо-пептонном агаре под вазелином, а также в лиофилизированном виде. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1.Авторское свидетельство СССР 538024, кл. С 12 D 13/10, 1975. 2.Doi R. Current topics in cellular reguliatIon,v.6,p.i-18, 1972 (прототип).