Штамм бактерий ТнеRмUS RUвеR-продуцент рестриктазы TRU 9 1 Советский патент 1991 года по МПК C12N9/14 C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять нуклеотид- ную последовательность 5 ТТАА 3 .

Цель изобретения - выявление штамма Thermus ruber - продуцента рестриктазы, являющейся изошизомером Mse I, обладающего более высоким выходом.

Штамм Thermus ruber 9 выделен из горячих источников и депонирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером В-1730 D.

Штамм обладает следующими свойствами.

Морфолого-культуральные признаки. Палочки диаметром 0,5-0,75 мкм, длиной 3-6 мкм или нитевидные клетки длиной 15- 40 мкм. Бактерии грамотрицательные, неподвижные, жгутики и споры отсутствуют.

Колонии на картофельно-пептонном агаре ярко-оранжевого цвета, круглые, блестящие, гладкие с ровным краем. В жидкой картофельной среде в пробирках рост в виде мути у поверхности среды.

Физиологические признаки. Строгий аэроб, оптимум роста 60°С, рН оптимум 7,8- 8,2. Хороший рост наблюдают на картофельной среде (20%) с 0,5% пептона и 0,02% дрожжевого экстракта. Время генерации 60 мин.

О 00

VJ о

Бактерии хорошо растут на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамно- зой, галактозой, хуже растут на среде с маннитом и глицерином. Хороший рост отмечен на натриевых солях уксусной, пировиноградной,яблочной,янтарной и фу- маровой кислот. Слабый рост на L-фруктозе, ксилозе, L-арабинозе, раффинозе. Нет роста на среде с инулином, сорбозой, декстрином и лимоннокислым натрием. На среде с 0,25% глюкозы обнаружен рост, при концентрации глюкозы 0,5% рост бактерий ин- гибировался.

Нет роста на среде с аланином, глицином, аспарагином, нитратом, сульфатом аммония и мочевиной. Растет на среде с гистидином, аспарагиновой кислотой, хуже с метионином и орнитином. На синтетической среде с лактозой хорошим источником азота является пептон.

Бактерии не восстанавливают нитраты до нитритов, крахмал и казеин не гидроли- зуют, молоко, разбавленное в 5 раз, свертывают и пептонизируют, гидролизуют желатин в концентрации 10 и 50%, сероводород, индол и ацетоин не образуют, серу и тиосульфат не окисляют. Бактерии чувствительны к NaCI в среде (1% NaCI в среде ингибирует рост бактерий), образуют ката- лазу, антибиотики не образуют. Культура способна растворять клеточные стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий. Минимальная температура роста на агаризованной картофельной среде 40°С, оптимальная 60°С, максимальная 70°С.

Культуру хранят в лиофильно высушенном состоянии.

Для культивирования T.ruber 9 применяют питательную среду следующего состава. %:

Картофельный отвар 20

Пептон0,5

Дрожжевой экстракт 0,02

рН7,8-8,2.

Культивирование проводят при 60°С в течение 14 ч.

Выход биомассы 1 г/л культуральной жидкости.

Выход рестриктазы Tru 91 6000 ед/г биомассы.

Пример. Культивирование штамма, получение биомассы.

Клетки Thermue ruber высевают на твердую среду, содержащую 20%-ный картофельный отвар, 0.5%-ный пептон и 0,02%-ный дрожжевой экстракт, инкубируют в течение 1 сут при 60°С. затем вносят петлей в 100 мл жидкой срг-д1-1 oro же состава и подращивают п темоние - I ч при 60°С. Полученный инокумчт пнгн.чт в 2 л среды и

выращивают при 60°С. в течение 14ч. После охлаждения клетки собирают центрифугированием. Выход биомассы 1 г сырой массы с 1 л среды.

Получение рестриктазы Tru 91.

2 г клеток суспендируют в 20 мл 0,02 М буфера трис-HCI, рН 7,5, содержащего 10 М / -меркаптоэтанола и 0,1 % тритона Х-100, и разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе. Обломки клеток удаляют центрифугированием, надосадочную жидкость наносят на 20 мл фосфоцеллюлозы Р-11 (Whatman), уравновешенной буфером А (0,02 М К-фосфат, рН 7,5, 0.001 М Ј-меркаптоэтанол, 510 М ЭДТА). Затем колонку промывают буфером А до исчезновения УФ-поглощающего материала в элюате. Адсорбированный материал элюируют 240 мл градиентом 0-1,0 М NaCI в буфере А. Объем

каждой фракции 8 мл. Аликвоты из каждой фракции (мкл) инкубируют 1 ч при 60°С с 1 мкг ДНК фага Аи анализируют в геле агаро- зы. Фракции, расщепляющие ДНК фага А (24-28), объединяют, диализуют 4 ч против

2 л буфера А и наносят на колонку с 10 мл бензил-ДЕАЕ-целлюлозы (Segma).

Фермент элюируют 120 мл градиентом 0-1,0 М NaCI в буфере А. Объем фракций 4 мл. Фракции 6-8, содержащие рестриктазную активность, объединяют, диализуют 2 ч против 2 л буфера А и наносят на колонку с 5 мл гепарин-сефарозы (Pharmacia). Элю- цию ведут линейным градиентом NaCI 0-1,0 М в буфере А объемом 60 мл. Объем фракций

2 мл. Фракции 13-14, содержащие Tru 91, объединяют и диализуют против буфера А с 50%-ным глицерином. Полученный препарат фермента (1 мл) имеет активность 12000 ед/мл.

За единицу активности принимают минимальное количество фермента, необходимое для полного расщепления 1 мкг ДНК фага А в течение 1 ч при 60°С,

Ферментный препарат хранят при -20°С.

Выход фермента 6000 ед/г биомассы.

Определение последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Tru 91.

Для определения последовательности нуклеотидов, узнаваемой рестриктазой Tru 91, проводят сравнение экспериментально полученных длин фрагментов при гидролизе ДНК фага А и pBR 322 с расчетными длинами фрагментов для различных нуклеотидных последовательностей. Проведенный анализ показал, что существует единственная последовательность, для которой расчетные длины фрагментов совпа516876146

дают с экспериментально полученными для работах. Выход Тги 91 в 3 раза превышает Тги 91, а именно последовательность ТТАА. выход известного соответствующего фермента.

Таким образом, фермент Тги 91 являет-Формула изобретения

ся изошизомером Mse I и может быть исполь- 5Штамм бактерий Thermus ruber BKM

зован вместо него во всех генно-инженерных В-1730 Опродуцент рестриктазы Тги 91.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Цель изобретения - выявление штамма Thermus ruber - продуцента рестриктазы, являющейся изо- шизомером Mse I, обладающего более высоким выходом. Штамм Thermus ruber В КМ В-1730Д (9) получен в результате поиска продуцентов-рестриктаз среди термофильных бактерий горячих источников, хорошо растет на синтетической среде с сахарозой, мальтозой, рамнозой, галактозой, на натриевых солях уксусной, пировиног- радной, яблочной, янтарной кислот, не восстанавливают нитраты до нитритов. Выход фермента 6000 ед/г биомассы, что в 3 раза больше известного, активность 12000 ед/мл.