Штамм а-18-продуцент 5 -экзонуклеазы Советский патент 1980 года по МПК C12N15/00 C12D13/10 

(54) ШТАММ ACTINOMYCES COELiCOLOR А-18 ПРОДУЦЕНТ 5-ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической про- мышленности и может быть использовано для получения 5 -мононуклеотидов,при-5 меняемых в пищевой промышленности для улучшения вкусовых качеств готового продукта и в медицине..

Известен штамм aктинo ицeтa Actinomyces-сое 1icol or A-5, продуцирую- tO ЩИЙ внеклеточную 5-экзонуклеазу. Этот штамм характеризуется уровнем биосинтеза внеклеточной 5-экзонуклв. азы при культивировании глубинным способом на среде, содержащей осаха- j ренные пшеничную муку и,крахмал,соли в пределах 100 ед/мл Щ.

Целью изобретения является получение штамма акт иномицета Actinomyces coell color A--18, отвечающего тре-2о бованиям ферментного производства, т.е. обладающего повышенной способностью к биосинтезу 5 -экзонуклеазы.

Штамм Act nomyces coellcolor А-18 получен в результате многократ- 25 ного рассева исходного штамма Actinomyces coel{color A-5. Полученный штамм Actlnomyces coellcolor A-i8 подвергсши проверке на ферментативную активность при хранении и пересевах на агаризрванной питательной среде.

Полученный штамм имеет следующие морфологическую и физиологическую характеристики.

Морфологи я. Твердая среда, содер-i жащая осахаренные ci-амилазой пшеничную муку и растворимый крахмал, соли. Мицелий имеет вид очень тонких разветвленных гиф. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина кл.еток мицелия варьирует от 0,71 до 0,93 мкм. Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками, нередко с примитивными спиралями, расположены моноподиально, одиночно. Споры овальные, шаровидны,е, с гладкой оболочкой.

Культуральн о-Л и з и ологические признаки. При выращивании на твердой питательной среде колонии штамма Actinomyces соеli А-18 неправильной округлой формы, поверхность бугристая, выпуклая, края неровные(рваные), .воздушный мицелий отсутствует. Колонии частично окрашены в темно-розовый ивет. Диаметр гигантской колонии на 10-е сутки роста 10-12 мм. Нижняя поверхность колонии гладкая, среда

не буреет, пигмент в среду не выделяется.

На агаризированной среде Чапека с 3% сахарозы рост слабый, растет , почти прозрачной пленкой, колоНИИ круглые, поверхность ровная, воздушный мицелий слабо развит -светло-розового цвета, диаметр колонии 6 мм,.

На крахмал-аммиачной среде рост слабый, тонкой пленкой,среда не окрашена, диаметр колонии 3 мм.

На МПА образует небольшие колонии неправильной формы диаметром 8 ivw, растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слегка выступающей над поверхностью эгара, края колонии неровные, воздушный мицелий скудный, не окрашенный, среда не буреет.

На сусло-агаре растет хорошо в виде мощной пленки(морщинистой)крюмрвого цвета, воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, края волнис-i Тые, -диаметр 15 мм.

.На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщинистой пленки, окрашенный в красновато-розовый цвет, края колонии волнистые, диаметр 7 мм, воздушный мицелий скудный, белого цвета.

На синтетической среде растет хорошо в виде небольших колоний(диаметр 6-7 мм),колонии гладкие, в центре слегка морщинистые, край неровные, колонии бесцветные или слегка розовые . .

На ломтике моркови рост слабый в месте укола на ломтике картофеля рост слабый в верхней части столбика :В виде морщинистой пленки кремового цвета.

Мясо-пептонную желатину не раэжи жает. , - - - . Молоко хорошо пептонизирует на 10-е сутки.

Нитраты не восстанавливает. Отношение к углеводам. Крахмал гидролизует, сахара потребляет с подкислением среды.

Отношение к температуре. При рост хороший, сплошной пленкой,желтого цвета, у верхнего края косяка скудный воздушный мицелий белого цвета. При 30° С рост такой лее, мицелий мес±ами окрашен в красный цвет. При рост хороший в нижней части косяка в виде морщинистой пленки. При 50 С рост отсутствует.

.1 . СпосЬб получения Actlnomyces coel tcolor А-18 состоит в подготовке материала для селекционной работы, и выделении гйоноконидиальных культур, изучении их естественной изменчивости по признаку образования фермента и отбору лучших штаммов, служивших затем исходными культурами для про: ведения последующихэкспериментов. „

Дальнейший этап исследования сос тоял в подборе питательной среды.Были проверены среды с различным содержанием пшеничной муки и растворимого крахмала,, пшеничную муку и растворишай крахмал осахаривали d -амилазой(0,5 гЫ-амилазы ГЗХ на 40 г муки или крахмала), добавляли соли в различных концентрациях. В результате была подобрана оптимальная питательная среда следующего состава,%:

мука пшеничная, прогидролизованная ci -амилазой, 2, растворимый крахмал, прогидролизованный ct амилазой, 2, сульфат аглмония 0,6, мел 0,6, калий хлористый 0,1, агар-агар 2. Культивирование штамма Actinomyces coelIco}or А-18 в глубинных условиях проводили на жидкой питательной среде того же состава, только без агара. Рост штамма на указанной среде в условиях глубинного культивирования на качалке при 180 об/мин и температуре 28-30 С очень интенсивный, имеет вид густой кашеобразной массы. Максимальное образование фермейта йаблюдается после 72-х часов -роста. Показатели общей нуклеазной активности, определяемой спектрофотометрическим методом по изменению поглощения кйс-г5 лоторастворимьох продуктов распада

РНК(6 мг/мм).составляет 200 ед/мл

фильтрата культуральной хсидкости. Показатели активности исходного штамма не превышают 100 ед/мл.

Таким образом-, предлагаемый штамм Actinoroyces coeMcolor А-18 позволяет получить внеклеточную 5 -эКзонуклеазу, микробного происхо)едения, ис- пользуемую в пищевой промышленности

для улучшения вкусовых качеств продуктов и для медицины, а также для

получения 5 -мононуклеотидов. Активность штамма Actlnomyces coelicolor А-18, продуцирующего внеклеточную 5 -экзонуклеазу, по сравнению с исходным штаммом Actlnomyces coelicolor

А-5 в 2-3 раза выше и составляет 200.250 ед/мл.

Пример . Для получения препа.рата 5-экзонуклеазы штамм Actlnomyces coelicolor выращивают при температуре при аэрации 1 объем воздуха на 1 объем среды в течение 48 ч. Активность 5 -экзонуклеазы 400 ед/мл. Фильтруют/ в полученном фильтрате доводят рН до 5,5, добавляют в качестве стабилизатора и осаждают

фермент 2,5 объемами ацетона.

Получают препарат 5-экзонуклеазу Г10Х активностью 40 тыс.ед/г. Выход препарата с 1 м 8000 г.

Использование предлагаемого

штамма Асt}nomycesсое И color А-18 даст возможность получать высокоактивный внеклеточный фермент при глубинном кул тйвирований и тем самым интенсифицировать процесс производства.

f Формула изобретения / Штс1мм Actinomyces coellcoTor .18 - продуцент 5 -экзонуклеаэы.Хранится в коллекции культур микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции Промышленных микрооргайизмов. Регистрационный номер № ЦМПМ-5-4б4.

Морфологические .п р и 3 н.а к и. Твердая среда, .содержащая осахаренные -амилазой пшеничную муку и крахмал, соли. Мицелий имеет вид очень тонких разветвленных гиф. Стенки клеток мицелия прямые. Ширина клеток мицелия варьирует от 0,71 до 0,93 мкм. Спороносцы спиральные, с 1-3 завитками, нередко с примитивными спиралями,расположенными моноподиально, одиночные. Споры овальные, шаровидные, с гладкой оболочкой. .

Культурально-физиологические признаки. На твердой питательной среде колонии неправильной округлой , края неоовные, воздушный мицелий слабый, колонии сеоого или розовато-красноватого цвета. Диаметр гигантской колонии иа 10-е сутки роста 10-12мм. Среда не буреет, пигмент в среду не ъьщеляется.

На агаризованной среде Чапека с 3% сахарозы рост слабый, растет тонкой, почти прозрачной пленкой. Колонии круглые, поверхность ровная,воздушный мицелий слабо развит - светло-розового цвета, диаметр колонии

6-7 N&1.

На крахмал-аммиачной среде рост слабьзй, тонкой пленкой, среда не окрашена, диаметр колонии 3-4 мм.

Иа МПА образует небольшие колонии неправильной формы диаметром 7-8 мм, растет в виде тонкой морщинистой пленки, в центре колонии слегка выс.тупающей над поверхностью агара.Края

, лонии-неровные, воздушный мицелий скудный, неокрашенный, среда не буреет. .

На сусло-агаре растет хррсшо в виде мощной морщинистой пленки кремового цвета. Воздушный мицелий отсутствует, колонии круглые, края волнистые, диаметр 12-15 мм.

На картофельно-пептонном агаре рост хороший, колонии в виде морщи нистой пленки, окрашенные в красно0вато-розоватый цвет. Края колонии волнистйе, диаметр 6-7 мм, воздушный мицелий скудный,белого цвета.

На синтетической среде растет хорсяшэ в виде небольших колоний диаметром 6-7 мм. Колонии гладкие, в ., центре слегка морщинистые, края неровные, колбйий бесцветные или слегка розоватые.

На ломтике моркови рост слабый в месте укола. На ломтике картофеля

0 рост слабый в верхней части столбика в виде морщинистой пленки кремового цвета.

Мясо-пёптонную желатину не разжижает .

5

Молоко хорсяйо пептонизирует на ip-e сутки. ,

Нитраты не восстанавливает. .Оптимальная температура роста 37.. Рост хороший в нижней части косяка в0 виде морщинистой пленки.

При рост отсутствует. Отношение к углеводам. Крахмал гидролизует, сахара употребляет с подкислёнием среды.

5 Активность йггамма Actlnomyces coelicolor А-18 составляет 200250 ед/мл фильтрата культуральной жидкости.

Источники информации, 0 принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР О 203837, кл. С 12 О 13/06, 1966 (прототип) .