Способ выделения -амилазы Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 

Изобретение относится к ферментной отрасли микробиологической промышленности и может быть использовано дпя вы деления грибной амилазы из раствора нативной культуральной жидкости. Известен способ выделения Л -амилазы из культуральной жидкости Asperg-i us предусгматривающий ее обработку . анионообменным гель-сорбентом, десорб1ШГО фермента в присутствии хлористого натрия с последующим выделением фермен та из элюента (1 . Однако при использовании анионообмен ного галь-сорбента (АГС) с сорбиионной емкостью 3,05-3,09 мг-экв/г, набухаемостью 8,4-11,4 МП/г в ОН-форме cqj6ция сорбента из раствора составляет 6О80%j используемый в качестве элюента 10%-ный раствор хлористого натрия обёспечивает 63-83%-ную десорбцию ферменTaj кроме того, указанный гель-сорбент гфименяется для очистки фермента без его концентрирования. Целью изобретения является повьпненив выхода и получение болре очищенного препарата. Для достижения этой цели из анионообменных гелЕ -сорбентов используют гельсорбент в С -форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,0- 6,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пределах 0,51,0 М, а выделение фермента осуществляют введением хлористого кальция концентрацией 0,5-1,5% при одновременном подкислении полученной среды до рН 6,06,2 с последующим осаждением органическим растворителем. Способ выделения Х -амилазы из культуральной жидкости Asperp iCCus включает в себя следующие этапы: сорбцию фермента на гель-сорбенте АГС-1а: десорбцию фермента с гель-сорбента АГСа: осаждение фермента из эпюата; лябфильное высушивание препфата высокоочтценной с -амилазы. 3 . e Проца::с осуществ1 -тот следующим образом. :Культуральную жндкбстьприестеставнном значений рН 7,5-8,0 обрабатывают в стат)ческйх или динамических условиях гель-сорбентом АГС-1а, синтезированном на основе поливинилового спирта, с сорб1ШОННОЙ емкостью гель-сорбента 1,49 мг экв/г, набухаа 4остыо 43,0 мп/г, в Cf.форме, так как предв ительные исследования показали, что гель-сс бент в С8форме проявляет высокую избирательную сорбционную способность к амилазе (см. табл. 1). . Таблица 1 В качестве десорбента рёкомбнхогётсЯ 1 М раствор ацетатного буфера рН 6,0, который с еспечивает десфбшпо фермент на 90-100% при 10 кратном концентрировании раствора. И цепях восстановления активных гру гепь-сорбента в раствор эгаюеита одновре менно вносят ионы хлора в-виде натриевой сопи (1,О М), Это дает возможность использовать гель-сорбент 5-7 раз без регенерации его српяной кислотой, которая требует большой затраты времени для отмывки сорбента водой до значения рН 7,0. Внесение ионов в раствор элюе та позволяет использовать его в последующем цикле сразу после промывки водопроводной и дистиллированной водой до значения рН 7,0. Промыва т г еттьсорбент водопроводной водой Гтргемя объемами) и три раза дистиллированной водой (двумя объемами). После 5-7 циклов испотьзования проводится полная регевфаиия гель-сорбента щелочью (один раз 7%-ным и два раза 5%-1НЫМ раствором) из расчета 3 объоиа щелочи на 1 объем смолы, затем от 484 мьюают его водопроводной водой до рН 7,0 и обрабатывают раствором сопя1 й кислоты (тремя объемами: один раз 7%-ным раствором и два раза 5%-ным раствором) с последующим отмыванием гель-сорбента водопроводной и дистиллированной водой до рН 7,0. Полная регенерация восстанавливает сорбшюнные свойства гель-сорбента, обеспечивая его 15-2 О-кратное использование. Пример 1 (контроль) . Используют гель-сорбент А ГС в ОН-форме с сорбционной елкостью 3,5 мг-экв/г, на- бухаемостью 8,4-.11,4мл/г, Элюирующий раствс 10%-ный хлористый натрий. Объем куттьтуральной жидкости ЮОмл, амилолитическая активность 2,6 ед/мл; общая активность 2.6О- остаточная активность 57. Сорбция достигает 78%. Получают 1ОО мл элюата с активностью 1,68 ед/мл: общая активность 168. Общий выход 64%. Десорбция 83%. Пример 2. Проводят сорбцию а лилазы из культуральной нативной жидкости в статических условиях на гельсорбенте АГС-Ja в СВ-ффме, сорбционная емкость 1,49 мг экв/г, набухаемость 43,О мг/г. Содержание гель-сорбента 2% по сухому весу. Амилолитическая активность культуральной жидкости 13,0-16,0 ед/мл; рН 7,5-8,0. Обработка культуральной жидкости гель-сорбентом проводится в емкости, снабженной мешалкой. Дпительность cqэбции 1 ч. Смола отделяется от раствфа фильтрованием и снова пер&нсюится в емкость для проведения десорбвди фермента. В качестве элюента используется ацетатный буфер (1 М) в присутствии ионов хлора (1,0 NaCf) рН 6,0-6,2. Количество элюента берут из расчета степени концентрирования фермента (в 3-10 раз меньше взятого на обработку раствора).. Десорёция проводится также при перемешивании раствора в течение 45 мин. Смолу отделяют фильтрованием и промывают водой для последующего 1шкла. . Данньде опыта сведены в табл. 2.

Т а 6 п и ц

Пример 3; Проводят сорбшпо амилазы из культур апьной нативной жидкости на гель-сорбенте. АГС-7а в С8-фор ме в динамических условиях: сфбционная емкость 1,49 мг-экв/г, набухаемость 43,0.мл/г. Раствор культурапьной жидкости (АС-20 ед/мл, рН 7,8) пропускают через колонку заполненную 40 г гель-сорбента, предварительно подготовленного . к работе. Скорость пропускания раствора 1,.0 л/ч. Пропускают 2,0 п культуральной жидкости из расчета, что СОЕ по амилазе составляет 750-100О ед АС/г, гельсс бента. Сорбция достш ает 100%. Десорбцию проводят ацетатным буфером {1 М) в присутствии ионов хлора (1,О MNaC ), рН 6,0. Скорость десорбции 0,5 п/ч. Степень концентрирования раствора 6 раз. Получено 334 мл эпюата с активност 12О ед.АС/МЛ. Общий выход 98%. Преимущество метода сорбдии амилаз .на гель-сорбенте А ГС-Га закл1очйется в том, что данный образен анионита позволяет работать в промышленных условиях с нативными растворами культуральной жийкости без предварительного диализа, обеспечивает концентрирование фермен- та за счет кспользования меныиих объемов элюента в 3-10 раз и приводит к 2-й Зт-кратной . очистке фермента по белку. Сорбция ф мента составляет 98-1ОО%, десорбция 9О-1ОО%. Общий выход фермента . после сорбции - десорбции 88-98%. Второй этап очистки включает в себя вьшеление фермента из элюата путем осаждения органическими растворителями. Условия осаждения амилазы из элюатов, полученных с гель-сорбента АГО-|а, следующие.. Элюат охлаждают до -4 С, вносят ионы кальция (CaCPg ) в концентрации 0,5% и рН раствора доводят уксусной кислотой (0,5 Н) до значений 6,0-6,2. Органические растворители этиловый спирт или ацетон - охлаждают до Рю)(-15) С. Осаждение белка гфоводится при непрерывном перемешивании раствора. Расход сннрта составляет 2,5 объема на 1 объем элюата. при осаждении достигают 15-20%. Общий выход вьк:рко«очищенного препарата от исходной активности составляет 75%. Полученные пр& параты проявляют активность 1000О120000 ед АС/Г при содержании белка 60%. Расход ацетона 1,5 объема на 1 объем элюата. Получены препараты с активностью 7500-8000 ед АС/г и с содфжанием белка 56%. Выход активности 72%.

Ацетон (25) 4275ОО 41,0

Этиповый

спирт (о,33) 440ОО

2,75 Таким образом, предлагаемый способ .выдепения ot -амипазы позволяет интенсифицировать процессы очистки и кондеитр рования ферментов, увеличить выход фермента на стадии концентрирования до 8898% и обеспечить общий выход высокоочищенного препарата на стадии осаждения из эпюата по отношению исходной активности культур апьной жидкости 70-75%. Формула изобретения Способ выделения сХ-амилазы из культуральной жидкости AspergiEtuer or-jrae прещгсматривающий ее обработку анионообменным гель-сорбентом, десорбцию фермента в присутствии хлористого натрия с последующим выделением фермента из

79ОО

324ООО

72

75

ЗЗООО

12000

75

75 эпюата, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и получения более очищенного препарата, из анионообменных гель-сорбентОв испопьзуют гель-сорбент в СЕ -форме, десорбцию фермента осуществляют ацетатным буфером рН 6,0-6,2, при этом концентрацию хлористого натрия устанавливают в пределах О, 5-1, О М, а выделение фермента осуществляют введением хлористого кальция концентрацией О,5-1,5% при одновременном подкйслении полученной среды до рН 6,0-6,2 с последующим осаждением органическим растворителем. Источники информации, . принятыево внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР № 319615, кл. d 08 F 216/06, 1969.