Способ очистки -амилазы Советский патент 1979 года по МПК A61K38/46 

(54) СПОСОБ ОЧИСТКИ оС-АМИЛАЗЫ

Изобретение о носится к о.6ласти физхимии, а именно к способу очистки фермента oiL-амилазы (КФ 3.2.1.1). Высокоочищенйые ферментные препараты могут найти применение в пищевой и фармацевтической промьашленности ив лабораторной практике. , В литературе описан способ очистк оС-амилазы из нативного раствора A.spergillus terricola при использова нии макррсетчатого карбоксильного катионита Ю1Т 1. По этому способу нативный раствор Aspergillus terrico la, содержащий амилазную и протеазную активности сорбируют на катиони КМТ в условиях полного насыщения сорбента амилазной активностью. Дал производят десорбцию ферментов с катионита. Однако по этому способу получают ферменты с небольшим выход продукта от нативного раствора: амилазы 15-20%, протеазы 25-30%. Ак тивные фракции ферментов содержат н более 70 - амилазы и 90 - проРЛЛпЛА . теазы. С.целью получения высококонцентр рованных злюатов, увеличения выхода фермента и сокращения длительности процесса предлагается сорбцию oL -амилазы на карбоксильном макросетчатом катионите, представляющем сополимер метакриловой кислоты и диметакриламида (КМда), пройодитьв условиях неполного (на 40-60%) насыщения сорбента сорбатом. Длительность процесса сорбции сокращается при этом в 1,5-2,0 раза. Оптима.пьным является проведение процесса сорбции амилазы ионитом КМДМ до концентрации фермента на выходе из колонки, составляющей 40-60% от концентрации амилазы в исходном растворе Выход фермента в процессе элюации при этом составляет 90100%, а концентрирование амилазы увеличивается в 2,5-3,0 раза по сравнению с полным насыщением катионита ферментом (см.таблицу). Процесс очистки оС-амилазы из нативного раствора spergillus terricola проводят следующим образом. 1. Производят дипегментацию нативного раствбра на анионите. ФАФ (К наб s 1,9-2,4), не сорбирующего фермент и задерживающего окрашенные примеси. Характеристикой процесса является зкстинкция при 350 нм (длина волны, характеризующая, пигменты Asp. ter ricola), обесцвеченный раствор не должен иметь ЕЗКО больше 0,1. 2.Производят сорбцию амилазы и протеазы из осветленного нативного раствора макросетчатым карбоксильным .катионитом КМДМ при равновесном зна чении рН 4, 0. 3.Производят десорбцию ферменTQB со смолы методом ступенчатой элюции. Т ступень. Десорбция амилазы 0,1 М аце атным буферным раствором рН 5,0. Контроль за ходом процесса осуществляют измерением оптической плотности элюатов при длине волны 280 нм и определением амилолитической активности. П ступень. Десор ция протеазы 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,0. Контроль - из мерение поглощения при.280 нм, опре деление протеолитической активности 4.Высокоактивные элюаты амилазы и протеазы подвергают лиофильной сушке. Описываемый способ дает возможно получить свобЬдный от примесей други белков (при диск-электрофорезе и по пиакриламидном геле при рН 7,5 и рН 8,9 получена одна полоса) амилолити ческий ферментный препарат. Кроме того, описываемый способ сокращает длительность стадии сорбции, элюция амилазы осуществляется в более мягк условиях, что важно при рабсУге с лабильными физиологически активными веществ ами. Пример 1. Нативный раствор амйлолитической активностью 36 - и протеолитической активностью 10 в количестве 5000 мл пропускают через колонку с анионитом ФАФ в С1форме с коэффициентом набухания 2,0. Объем смолы 200 мл. Депигмента ция нативного раствора происходит б потери амйлолитической и протесэлитической активностей. Обесцвеченный нативный раствор подкисляют до рН 4,0. Выход, на этой стадии составляет 75% по амйлолитической и 70% по протеолитической активностям от исходного нативного раствора. Весь подкисленный раствор (V 5000 мл) с активностями 27-М и 7,0- пропускают через колонку с 5 г КМДМ в смешанной натрий-водородной форме ( смола уравновешена 0,5м ацетатным буферным раствором рН 4,0). В этих условиях имеет мест 50%-ное насыщение смолы амилазой (активность на выходе из колонки в конце сорбции составляет 13,5 ТлТГ Процент сорбированных ферментов от всего пропущенного через катионит количества равен для амилазы 90, для протеазы 85, а выход ферментов стадии сорбции от исходного нативного раствора составляет 67,5% и 60% соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл 0,1 М ацетатным буферным раствором рН 4,0. Первую десорбцию осуществляют 0,1 М ацетатным буферным раствором рН БуО. Сначала выходит наиболее активная фракция амилазы 105 мл с активностью 900- , рН 4,7, не содержащая прот.еазы. Эта фракция содержит 77% от сорбированной амилазы .(или 70% от пропуенного количества). Затем следующие 300 мл элюата имеют активность от 25 до 10 - . Десорбция амилазы осуществляется с полным 100%-ным выходом от сорбированной амилазы. Однако для получения препаратов ферментов используют только высокоактивные элюаты. В случае фракция с активностью 900- составляет 84% от всей десорбйрованной амилазы и 52% от количества фермента в исходном нативном растворе (36 - X 5000 мл). Вторую десорбцию - элюцию протеолитического фермента осуществляют 0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,0. Протеаза выходит, начиная с рН 6,2. Высокоактивная фракция - 250 мл с активностью 98 - содержит в2% от сорбированной протеазы (или 70% от пропущенного количества). Всего десорбируют 91% сорбированного фермента. Выход на стадии десорбции протеазы в активной фракции составляет 49% от количества в исходном нативном растворе (10 -j х 5000 мл) . При лиофилизации элюатов ферментов потери не превышают 5,0%. Таким образом, общий выход от нативного раствора составляет:, амилазы порядка 50%, протеазы - 46%. Пример 2. Нативный раствор в количестве 5000 мл с активностью WA Шг пропускают через колонку с 200 мл анионита ФАФ в С1-форме с коэффициентом набухания 2,0. Потери ферментативной активности не наблюдается. Обесцвеченный нативный раствор подкисляют до рН 4,0. Амилолитическая активность подкисленного нативного раствора равна 25 -М протеолитическая - 7, . Выход на стадии подкисления для амилазы составляет 71%, для протеазы 70%. Сорбцию ферментов осуществляют на КМДМ, уравновешенном 0,5 М ацетатньм буферным раствором рн 4,0, количество сорбента 5 г. КМда насыщается амилазой на 45% (активность нативного раствора на выходе из колонки в конце сорбции 11,3 Тлл-) Процент сорбированных ферментов от пропущенного количества составляет для амилазы 85, для протеазы 85, а выход от исходного нативного раствора - 61% и 59,5% соответственно. После сорбции смолу в колонке промывают 20 мл 0,1 М ацетатным буферным растворсяи рН 4,0. Десорбцию амилазы осуществляют лри рН 5,0 0,1 М ацетатным буферным раствором. Первые lOS мл элюата имеют

активность 750 - и содержат 74% сорбированной амилазы (или 63% от .пропущенного количества), следующие 70 мл элюата имеют активность 190-j Всего десорбируют 95% амилазы, Десорб,цию протеазы проводят при рН 7,0 0,Ш (фосфатным буферным раствором. АК.ТИВ- ныв фракции начинают выходить при ,1, высокоактивная фракция про-:.теазы (250 мл) имеет активность 84-ггт - .«t л

и содержит 70%, от сорбированного фермента (или 60% от пропущённого кодичества) Всего десорбируют 90%

90 57

100 67

С - отношение концентрации фермента на вйходе из колонки к исходной концентрации в растворе, %. Формула изобретения Способ очистки об-амилазы (КФ. .3.2.1.1) из нативного раствора Aspergilfus terricola посрёДств хроматографии на макросетчатом карбоксильном катионите - сополимере метакриловой кислоты и диметакриламида, отличающийся тем, что, с целью получения высококонцентпротеазы. Так как для пoлsчeния препаратов ферментов используют высокоактивные элюаты ферментов, то выход на стадии десорбции от исходного нативного раствора составляет для амилазы порядка 51%, для протеазы 42%. .

При лиофильной сушке потери фер..ментативной активности минимальны и ае превышают 3%. Общий выход ферментов от нативного раствора составляет для амилазы порйдка 50%, для протеазы 40%.

50 29 45 30

75 40 рированных элюатрв, увеличения выхода фермента, а также сокращения длительности процесса, сорбцию амилазы проводят 6. условиях неполного на 40-60% насБнцения сорбента сорба. том. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР ,46.5912, кл..С 07 G 7/028, 1974.