Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале Советский патент 1979 года по МПК C07G7/02 C07F7/08 

(54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТА НА КРЕМНЕЧЕМСОДЕРЖАЩЕМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к улучшенному способу иммобилизации фермента на крем неземсодержащем материале, используемого в пищевой и химической промышленности, а также в медицине. Иммобилизация ферментов позволяет продлить их активность и сделать пригодными для регенерации и повторного испол зования. Одним из способов иммобилизации ферментов является их ковалентное присоединение к носителям, которые могут быть как-органическими, так и неорганическими. Последние обладают большей структурной стабильностью, мало чувствительны к изменениям рН среды и к микробиальным атакам. Известен способ иммобилизации ферме та, заключающийся в том, что кремнеземсодержащий носитель обрабатывают орг носиланом для введения функциональной группы, через которую носитель связывается с ферментом посредством поперечносщиваюшего агента Связывание осуществляют путем добавления этого к смеси раствора фермента с модифицированным носителем. В качестве пог-еречносшивающих агентов используют альдегиды и галоидные соединения дисульфонила. Недостатком известного способа является то, что при добавлении поперечносшивающего агента последний может не только соединять фермент с носителем, но и осуществлять сшивание молекул самого фермента, что приводит к снижению ферментативной активности получаемого продукта до 30 ед/г. Кроме того, предлагаемые поперечносшиваюшие агенты могут обеими функциональными группами реагировать с привитыми к поверхности группами, что приводит к уменьшению количества связанного белка (до 2%). По технической сущности к предлагаемому способу наиболее близок способ и мобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале путем взаимодействия кремнеземсодержащего материала, модифицированного аминонропилтриалкоксисилано 1, с поперочносшиваюшим агентом, например с тиофосгеном, в среде органического растворителя с последующей обработкой полученного продукта буферны раствором фермента при рН 9 2 J. Однако обработка крем:;еземсодер сащего материала, модифицированного аминопропилтриалкоксисиланом, тиофосгеном -длится около 4 ч,и вследствие невысокой активности изотиоцианатных групп последующая иммобилизация фермента на носителе длится около 2ч. Целью изобретения является упрощени процесса за счет сокращения времени реакции. Цель дос/игается тем, что кремнезе х содержащий материал, модифицированный аминопропилтриалкоксисиланом, подвергг ют взаимодействию с поперечносшивающим агентом, а именно с 2,4-толуилендиизоцйанатом, в среде органического растворителя с последующей обработкой .полученного продукта буферным раствором фермента. Отличителыгым признаком предлагаемого способа является использование в качестве поперечносшивающего агента 2,4-толуилендиизоцианата. Носителем могут быть кремнез-емсодержащие вещества, предпочтительно вещества с большой удельной поверхностью например вьюокодисперсная двуокись крем ния. Носитель обрабатывают органосиланом для введения в поверхность реакционноспособных аминогрупп. Подходящим органосиланом является 5 -аминопропилтриэтоксисилан и ему подобные. Затем такой носитель обрабатывают 2,4-толуилендиизоцианатом с целью введения изоцианатных групп, способных в мягких условиях быстро взаимодействова с ферментом. Благодаря различной активности изоцианатных групп 2,4-толуилендиизоцианат взаимодействует с носителем более активной группой в положении 4. При этом изоцианатная группа в положении 2 остается на поверхности свободной и способна взаимодействовать с аминогруппами белка. Мольное отнощение 2,4-толуилендиизоцианата к концентрации аминогрупп на поверхности носителя составляет 0,8-0,9:1,0. При меньщем отношении уменьшается количество связываемого фермента, а при большем - носител становится гидрофобным и плохо смач1ша ется водой. Предлагаемый способ может быть использован для связывания ферментов через их аминогруппы, поэтому предпочтительно применять те ферменты, в которых аминогруппь не . имеют существенного значения для проявления их активности. Пример. 25 г высушенного при 4ООСв течение 2 ч йэпрсила с удельЕюй поверхностью 175 м /г размещивают в 250 мл толуола и к смеси добавляют 5,6 г J-аминопропилтриэтоксисилана. Смесь кипятят с обратным холодильником при перемешивании в течение 2 ч, промывают избытком толуола и высушивают в вакууме при . Концентрация аминогрупп на поверхности полученного аминоорганокремнезема, определенная потенциометрическкм титрованием хлорной кислотой, составляет 1 ммопь/г. 2,5 г аминоорганокремнезема размешивают в 25 мл. четыреххлористого углерода и к смеси добавляют раствор 0,39 г 2,4-толуилендиизоцианата в 25мл четыреххлористого углерода. После полного перемешивания смесь промывают избытком четыреххлористого углерода и высушивают в вакууме при комнатной температуре. Полученный активированный носитель используют непосредственно для связывания фермента или хранят в ампулах, запаянных в -вакууме. 0,25 г фермента-al-амилазы, содержащей 96-98% белка и обладающей амилолитической активностью 280000 ед/г, растворяют в 1О мл 1 М фосфатного буфера с рН 7,0. Затем при медленном перемешивании к раствору быстро прибавляют 1 г активированного носителя, Caifзыв ание осуществляют при комнатной температуре в течение 10 мин. Далее иммобилизованный фермент поочередно промывают 1 М фосфатным буфером с рН 7,0. и 0,О05 М раствором ацетата кальция с рН 5,5 (по 200 мл) до исчезновения амилолитической активности в промывных жидкостях. Полученный продукт высушивают при 4 С и при этой же температуре хранят в сухом виде. Высушенный продукт содержит S-12% белка и обладает амилолитической активностью 800-1250 ед/г. Формула изобретения Способ иммобилизации фермента на кремнеземсодержащем материале путем

5 672203А

взаимодействия кремнеэемсодержашегов качестве поперечносшиваюшего агента

материала, модифицированного аминопро-берут 2,4-толуилендиизоцианат.

пилтриалкоксисиланом,, с поперечносши-Источники информации, принятые во

вающим агентом в среде органическоговнимание при экспер1изе

растворителя с последующей обработкой1. Патент США № 3669811, 195-63,

полученного продукта буферным раство-. 5 опублик. 1972.

ром фермента, от. л и чающийся2. Патент США N9 3519538, 195-63,

тем, что, с целью упрощения процесса,опублик. 1968.