Способ модификации полисахаридов Советский патент 1980 года по МПК C08B15/06 

Изобретение относится к химии .природных соединений, точнее к способам получения носителей (сорбентов для иммобилизации, а также для хроматографическсй очистки белков, в особенности ферментов. Известен способ модификации амин целлюлозы серюуглеродом и изобутилхлорфермиатом, позволяющий получить сорбенты для ковалентного связывания ферментов 1. Полученный сорбент может взаимодействовать с водой, в частности с атмосферной влажностью, что отрицательно влияет на его устойчивость. Использование его как сорбента для связывания ферментов возможно тольк в водных растворах, так как фермент не только не растворяются в органических растворителях; но и инактиви руются ими.Поэтому сорбент в процес се его применения взаимодействует не To.jibKO с ферментом, но и с раст ворителем - водой. Наиболее близким к предлагаемому является способ модификации целлюло зы путем ее обработки гексаметилендиизоцйанатом с целью получения производного цел.люлозы, содержаиего .свободные изоцианатные группы, пригодного для использования в качестве сорбента иммунобелков 2. Однако применение таких соединений для иммобилизации белков (в том числе ферментов) осложнено тем, что из-за реагирования изоцианатов со всеми реакционноспособными группами белков легко происходит потеря каталитической активности ферментов, вследствие модификации активного центра или других участков, а также тем, что значительное количество содержащихся изоцианатных групп теряется в побочной реакции гидролиза, поэтому сорбционная емкость носителей небольшая. Цель изобретения - разработка способа получения, модифицированных полисахаридов, пригодных .для иммобилизации и хроматографической очистки белков, в том числе ферментов, облгщающих химической стабильностью, повышенной сорбционной емкостью, и тем самым расширение арсенала носителей (сорбентов) . Указанная цель достигается тем, что модификация полисахаридов осуществляется их обработкой диизоцианатами с последующей дополнительной обработкой бифункциональными или

Монофункциональными соединениями в стехиометрическсйч избытке.

В качестве бифункциональных сое- динений используют алифатические диамины и дикарбоновые кислоты С«- С а в качестве монофункциональных соединений используют алифатические ,

спирты Cj- CQ,

В качестве нерастворимого полисахарида прнмен)т целлюлозу, агароау, декст ран, хитин, крахмал и их производные в виде порошков или гранул. Реакция с диизоцианатом проводится в безводных органических растворителях, не содержащих подвижных атомов водорода,, например, в д и океане, ацетон е,хл о ро(|юрме и др. Реакцию катализируют третичные основания и кислоты, наиболее подходящим является триэтиламин. Предпочтительны умеренные температуры - 20-50 С,

Промежуточное производное после-удаления непрореагировавшего диизоцианата промыванием органическим растворителем,Подвергают взаимодействию с бифункциональньлм или монофункциональным соединением, содержащим подвижные атокжа водорода, структура которого: выбирается в зависимости от назначения носителя. Реакция проводится в присутствии органического растворителя и катализатора, как указано для первой стадии, или без растворителя, применяя избыток реагента.

В зависимости от длины алифатической цепочки Я получают носители с различной отдаленностью функциональных групп (-NHj, -СООН и др.) от полисахаридной матрицы.

Пример 1. Получение носителя, содержащего аминогруппы. К суспензии 3,0 г порошковой ц.еллюлозы в 30 мл безводного диоксана прибавляют 1 мл 2,4-толуолдиизоцианата, 5 капель триэтиламина и смесь медленно перемешивают б .4 при температуре 40-5О С. Затем целлюлозу отфильтровывают, промывают на фильтре 5-6 порциями диоксана по 20 мл. Полученное промежуточное производное по данным элементарного анализа содержит 4,7%N. В ИКспектре имеется полоса поглощения при 2270 , соответствующая свободным изоцианатным группам. Производное суспендируют в растворе 0,2 г гексаметилендиамина в 30 мл диоксана, содержащего 5 капель триэтиламина. Смесь нагревают 4, ч при 6080 с, после чего носитель отфильтровывают, промывают несколькими порциями диоксана,смеси диоксан-вода 1:1 и водой. По данным элементарного анализа продукт содержит 6,5% N. Концентрацию вводимых аминогрупп можно варьировать путем изменения исходного соотношения полисахариддиизоцианат, а также изменением интенсивности условий реакции. Полученный носитель, содержащий

аминогруппы, активируют известным глутаральдегидным методом и исполь,зуют для иммобилизации ферментов.

Результаты определения активности нгданобилизованных препаратов приведены в таблице. Для сравнения там же приведены данные, полученные при иммобилизации тех же ферментов йа широк он спал ьзуемс носителе макропористом аминосилохроме С-80 проведенной в аналогичных условиях и с теь же исходным соотношением фермент:носитель.

По примеру 1 242 6220 6,1

Аминосилохром С-80 152 2270 1,4

П р и м е р 2, Получение носителя, содержащего карбоксильные группы. Носитель получают как в примере 1,

только вместо раствора гексаметилендиамина применяют раствор 2,0 г

себациновой кислоты в 30 мл диокса- . на. По данным элементарного анализа продукт содержит 4,5% N. Для иммобилизации ферментов синтезированный

носитель активируют водорастворимым карбодиимидом известным методом., Получены иммобилизованные препараты с активностью глюкозооксидазы 1120 Е/г, аспергил{1опепсина - 6,2 Е/г.

Пример 3. Получение носителей, содержащих гидрофобные радикалы. Получение носителя ведут как в примере 1, только вместо раствора гексаметилендиамина используют октиловый спирт. После аналогичной обработки получают носитель, содержа1ЧИЙ октиловый остаток, присоединенный к фенильному кольцу через амидную связь (по данным элементарного анализа продукт содержит

4,0% N). Функциональные свойства носителя обусловлены гидрофобным взаимодействием с молекулами белков. При адсорбционной иммобилизации глюкозооксидазы на этом носитепе получен препарат с активностью 80 Е/г, в то время как при применении исходной немодифицированной целлюлозы активность равна нулю. Аналогичным образом модифицирована сефароза CL-4B, только в этом

случае водная суспензия носителя переводится в органический растворитель и обратно в водную среду промыванием смесями дноксан-вода с постепенно увеличивающейся (обратно-уменьшающейся) концентрацией