Способ иммобилизации ферментов в полиакриламидном геле Советский патент 1979 года по МПК C08F220/56 

Изобретение относится к биохимиче кой технологии, связано с разработко биохимических методов анализа. Применение иммобилизованных ферме тов позволяет создать новые методы анализа веществ биохимического харак тера, основанные на применении ферментных электродов, колонок с иммоби лизованными ферментами и т.д. Известен способ иммобилизации фер ментов в полиакриламидном геле путем радикальной полимеризации в водном растворе, содержащем 0,1-2 вес.% фер мента, акриламида и Ы,Ы-метиленбисакриламида в соотношении 95:5 соответственно. В полимеризационную смесь дополнительно вводят высокомолекуляр ный йолисахаридкрахмал 11. Так, например, полимеризационную смесь, содержащую (%) 16,7 акриламида, 0,53. Ы,Ы-метиленбисакриламида, 10 акрилата натрия, 0,17 фермента каталазы и 1,67 крахмала, замораживают и облучают радиацией 0со дозой 54 крад. Иммобилизованная каталаза сохраняла 94,1% исходной активности. Этот способ ускоряет полимеризацию и увеличивает степень псшимеризации мономеров при радиациогпюй поли меризации замороженной смеси. В случае особенно чувствительных ферментов, таких как пропионилхолинэстераза, применение крахмала не дает нужного эффекта. Это связано с тем, что изза высокого молекулярного веса крахмала практически невозможно ввести его В реакционную смесь в концентрации более нескольких процентов. Недостатком известного способа является то, что низкая концентрация полисахарида не обеспечивает достаточное сохранение активности пр1опионилхолинэстеразы во время иммобилизации . Целью изобретения является уменьшение инактивации фермента в ходе полимеризации. Указанная цель достигается тем, что в водный раствор вводят сахарозу в количестве 15-50 вес.%. Применяют радиационную полимеризацию, а также химическую полимеризацию с использованием в Качестве катализатора смеси надсернокислого аммония и N,N,N,N-тетраметилендиамина в соотношении 1:1 соответстьенно. Пример 1. Пропионилхолинэстеразу растворяют в 25%-ном раствоое сахарозы в 0,06 М боратном буфе ре,рН 6,0. 6 объемов полученного раствора смешивают с 2 объемами 150%ного раствора мономеров (акриламид и Ы,Ы-метиленбисакриламид в соотношении 95:5) / в к1чее iireaSlf 3p5B добавляют 1 объем 2,5%-ного раствора N,N,N,N -те€раметилэтилендиамина и 1 объем 2,5%-ного раствора надсернокислого аммония. Все раствйрй перед смешением охлаикдают до 1-ZC и полученHji) cMiecb выдерживают при той же температуре 2 мин. Полученный 6Jiok геля Шмёльчают протиранием ietpes сито с отёерстйями 0,6 мм, далее препарат промывают вышеуказанным буферным раствором и сохраняют до применения в холодильнике. Сохранеййе активности при иммобилизации не ниже 30% cfi исходной.,

Пример 2. Пропионилхолин эстеразу растворяют в 50%гне « растйоре сахарозы в 0,06 М боратном буфере, рН 6,0. 8,6 объемов пЬйучённбгб раствора смешивают с 1,4 объемгили 50%-ного раствора мономеров. Полученную г смесь облучают|-лучами, доза радиации 6 крад. Раствор выдерживают во время облучения при . Измельчение и промывку проводят, как в примере 1. Сохранение активности не ниже 15% от исходной. Без наличия сахарозы в этих условиях гель не образуется.

Пример 3. АМиноацилазу растворяют в 50%-ном растворесахарозы в 0,1 М фосфатнол буфере, рН 7,2. 7 объемов полученного раствора смешивают с 3 объемами 50%-ного раствора мономеров (акриламид и Ы,Ы -метиленбисакриламид в соотношении 95:5). Полученный раствор облучгиот f-лучами, доза радиации 15 крад. РаСтВбр выдерживают во время об.пучения при , Полученный блок геля измельчают протиранием через сито С отверстиями 0,4 мм, полученный препарат промывают вышеуказанным буфером. Сохранение активнсюти не ниже 15% от исходной.

Полученные результаты показали, что высокие концентрации (15-50%) сахарозы значительно ускоряют образование полиакриламидного геля из мономеров и придают гелю более однородную структуру. Опыты показали, что в присутствии сахарозы реакцию полимеризации акрильных монсмеров можно провести при более низких концентрациях инициаторов или при значительно более низких дозах радиации что уже: само собой уменьшает инактивацию фермента в ходе полимеризаци Кроме того, проведение полимеризации в присутствии сахарозы выявляет определенное защитно действие и позволяет получить геАи, стабильность которах при работе в несколько раз выше стабильности, полученноЙ1;обь1чной полимеризацией.

изобретения

Способ иммобилизации ферментов в полиакриламидаом геде путем радикальной поЛийер з цМи в водном растворе, содержащем 0,1-2 вес.% фермента, акриламида и М,н-метилёнбнсакриламида 3 соотношений 95:5 соответственно, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью уменьшения степени инактивац фермента в процессе полимеризации, в водный раствОр вводят сахарозу в количестве 15-50 вес.%.

Источники информации, принятые во йниМайие при зкспертизе

1. Патент Японии № 7442876, кл. 36/2/ С 05, 22.04.77.