Способ обнаружения микрокапсульных микроорганизмов Советский патент 1979 года по МПК C12K1/00 

.1

Изобретение относится к области микробиологии. .

Известен способ обнаружения микрокапсульньтх микроорганизмов путем микроскопирования исследуемого материала 1. Способ позволяет выявить микрокапсульные формы микроорганизмов при значительном их содержании в исследуемом материале.

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что исследуемый материал предварительно смешивают и инкубируют со взвесью лейкоцитов в плазме свежевзятой крови восприимчивого к данной инфекции организма из расчета 5-30 микробных клеток на 1 лейкоцит.

Способ осушествляют следуюш;им образом.

Кровь от донора берут в пробирку с внесенным в нее гепарином, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре до оседания эритроцитов (20 мин). Затем отбирают верхнюю часть пробы, содержащую лейкоциты, взвешенные в плазме крови. Суспензию живых микробов после установления их числа по стандарту мутности или каким-либо другим приемом смешивают со взвесью лейкоцитов в плазме крови таким образом, чтобы отношение микробов и лейкоцитов в реакционной системе составляло 5-30 микроорганизмов на 1 лейкоцит. Полученной реакционной системой заполняют камеры гемоцитометров (Горяева, Бюркера. Тома или другие) и содержимое каждой камеры герметизируют по периметру покровного стекла расплавленным парафином. Приготовленные таким образом камеры с реакционной системой инкубируют в течение 1-5 ч. Через определенные промежутки времени, которые зависят от вида и величины внесенной дозы микроорганизмов, покровные стекла с отлечатанными на них препаратами снимают с камеры, высушивают, фиксируют, окрашивают общеупотребительными приемами и подвергают микроскопированию. В результате взаимодействия лейкоцитов и микробов, которым свойственно образование микрокапсулы, в отпечатанных на покровных стеклах препаратах четко выявляются бескапсульные формы микробов, фагоцитированные и перевариваемые лейкоцитами, и микрокапсульные формы микроорганизмов, расположенные вне лейкоцитов.

Пример 1. 0,1 мл двухчасовой культуры возбудителя брюшного типа, штамм

ТУ2-4446, выращенной на агаре Мартена

при 37°С и смытой с поверхности агара бульоном Мартена, вносят в 0,4 мл свежеприготовленной взвеси лейкоцитов в плазме крови здорового человека, взятой за 0,5 ч до внесения микроорганизмов. Отношение возбудителей брюшного тифа и лейкоцитов составляет 11:1, Полученную таким образом реакционную систему вносят в 7 камер Горяева, герметизируют расплавленным парафином и инкубируют при 37°С в течение 4 ч, снимая покровные стекла для анализа с интервалом в 0,5 ч. Фиксируют отпечатанные на покровных стеклах препараты, окрашивают их азур-эозином по Романовскому-Гимза и микроскопируют.

Обнаружено, что после 3 ч инкубирования (в препарате из 5 камеры) большая часть бактерий поглош,ена лейкоцитами, а из микробов, оставшихся нефагоцитированными, 70% имеют микрокансулу, окрашенную в розовый цвет.

Пример 2. 0,1 мл взвеси живых менингококков штамма А-208 в бульоне Хоттингера, полученных из двухчасовой культуры возбудителя, выращенной на сывороточном агаре Хоттингера, вносят в 0,6 мл взвеси лейкоцитов в плазме крови человека, полученной так, как это указано в нримере 1. Отношение менингококков и лейкоцитов составляет 25 : 1. После перемешивания реакционную систему вносят в 5 камер Горяева, герметизируют расплавленным парафином и инкубируют при 37°С в течение 3 ч, снимая покровные стекла с интервалом в 0,5 ч, фиксируют отпечатанные на покровных стеклах препараты, окрашивают их азур-эозином по Романовскому-Гимза и микроскопируют.

Найдено, что после 2 ч инкубации (в препарате из 3 камеры) подавляющее число менингококков поглощено лейкоцитами, а из нефагоцитированных диплококков около 80% имеют микрокапсулы.

Пример 3. 0,2 мл культуры золотистого стафилококка, выделенного от больного стафилококковым эндофтальмитом и прошедшего 3 пересева, после выращивания на агаре Хоттингера в течение 18 ч и смыва бульоном Хоттингера с 2% глюкозы, вносят

в 0,6 мл свежеприготовленной взвеси л ейкоцитов в плазме крови кролика, не имеющего антител к стафилококку. Кровь от кролика берут за.0,5 ч до составления реакционной системы. Отнощение стафилококков к лейкоцитам составляет 27 : 1. Полученную таким образом реакционную систему вносят в 7 камер Горяева, герметизируют расплавленным парафином и инкубируют при 37°С в течение 4 ч, снимая цокровные стекла с интервалом в 0,5 ч. Фиксируют отпечатанные на покровных стеклах препараты, окрашивают их азур-эозином но Романовскому-Гимза и микроскопируют.

Обнаружено, что через 2,5ч после начала инкубации реакционной системы (в препарате из 4 камеры) около 90% стафилококков, находящихся вне лейкоцитов, имеют нежно-розовую микрокапсулу.

Предлагаемый способ позволяет надежно обнаруживать микрокапсульные формы микроорганизмов - возбудителей инфекций, в том числе при первичном обнаружении сравнивать по признаку образования микрокапсул различные штаммы одного и того же микроорганизма, проводить исследования по обнаружению микрокапсул в любой баклаборатории, поскольку способ является простым в исполнейии и не требует применения сложной аппаратуры (электронного микроскопа).

Формула изобретения

Способ обнаружения микрокапсульных микроорганизмов путем микроскопирования исследуемого материала, отличающийс я тем, что, с целью повыщения точности способа, исследуемый материал предварительно смещивают и инкубируют со взвесью лейкоцитов в плазме свежевзятой крови восприимчивого к данной инфекции организма из расчета 5-30 микробных клеток на 1 лейкоцит.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Езенчук Ю. В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М. «Наука, 1977.