Способ подавления иммунитета к энтомопатогенным бактериям у насекомых Советский патент 1979 года по МПК A61K39/00 A01N9/00 

1

Изобретение относится к области сельского хозяйства, в частности к защите растений от насекомых-вредителей, и может быть использовано в качестве биологических способов подавлеиия развития насекомых-вредителей.

Воздействие на насекомых физиологически активными веществами приводит к тому, что насекомые на время их действия заменяют обменные процессы и таким образом сохраняют целостность популяции.

Цель изобретения заключается в повышении эффективности борьбы с насекомыми и предотвращении загрязнения окружающей среды.

Для этого в качестве активного вещества берут антигемоцитарную сыворотку насекомых.

Предложенный способ основан на новом принципе, который заключается в использовании иммунохимических свойств насекомых.

Способ осуществляют следующим образом. Гусеницы с очищенным пищеварительным трактом помещают в консервант, где удаляют по одному сегменту от передней и задней частей тела и пищеварительный тракт, оставшееся тело измельчают и перемешивают, после чего полученный гомогенат фильтруют и центрифугируют.

Для длительного хранения клеток тела и гемолимфы при низкой температуре (до -20°С) использз ют раствор СМЭП, который состоит из 0,24М сахарозы, 0,004М ЭДТА, 0,01М фосфата натрия на 1000 мл дистиллированной воды, рН данного раствора 7,0.

Пример. Гусеницы Galleria mellonellaL V-VI-го возрастов дезинфицируют и оставляют на 5-6 ч для очистки пищеварительного тракта. Десять щтук живых гусениц помещают в 1 мл консерванта для избежания агглютинации, мелинизации и оксидации гемолимфы. Удаляют по одному сегменту из передней и задней частей тела. Затем удаляют пищеварительный тракт для предотвращения действия ферментов. Измельчают оставщееся тело гусениц, вместе с консервантом помещают на 7-10 мин в магнитную мешалку для полного выделения гемолимфы. Полученный гомогенат фильтруют и центрифугируют 6-7 раз по 1 мин при 1000 об/мин. Центрифугат оставляют на 30 мин при комнатной температуре и удаляют образовавшийся верхний жирообразный слой ватным тампоном.

Сливают плазму гемолимфы, а клетки заливают смесью СМЭП-а и глицерина: 1 мл гемоцнтов, 2 мл СМЭП-а и 1 мл глицерина.

Работу проводят при +4°С. Получепные клетки тела и гемолимфы хранят при -20°С.

Во избежание агглютинации, мелииизации и оксидации клеток применяют конссрвант следующего состава, г:

Цитрат натрия3,5

Глюкоза2,0

Левомиции0.015

на 100 мл дистилированной воды.

Для получения антигемоцитарной сыворотки иммунизировали 6 белых крыс по методике Вязова (1967) 4 раза с интервалом в 5 дней. Во время каждой инъекции вводили по 0,2 мл 50%-ной суснензии гемоцитов. Первую иммунизацию проводили подкожно, вводя каждой крысе по 0,2 мл 5%-ной суснензии в смеси с 0,04 мл адъюванта фрейнда. Последующие иммунизации нроводили внутримыщечно, вводя по 0,2 мл 50%-ной суспензии в смеси с 16666 т. е. пенициллина для предотвращения возможности инфекционного процесса.

Перед первой иммунизацией брали кровь для определения наличия у крыс естественных антител против гемоцитов гусепиц. Спустя 7 дней носле последней иммунизации крысы обескровливались. Полученную антисыворотку инактивировали при +56°С в течение 30 мнн и хранили при -20°С. В результате получен ряд антигемоцитарных сывороток. Титр гемоцитоглютинеиов 1 : 256-1 : 2048.

Антигемоцитарная сыворотка подавляет механизм иммуносистемы, в результате чего в клетках уменьшается выработка ирецппитирующих антител. (Антигемоцитарная сыворотка получена при иммунизации крыс клетками Galleria mellonella L, по Вязову 1967).

Использованне предлагаемого способа по данным заявителя позволяет одновременно получать значительное количество клеток и илазмы гемолимфы; избегать оксидации, мелинизации и агглютинации; лучше отделять клетки от плазмы. Кроме того, клетки и плазма гемолимфы хранятся длительное вре.мя при низкой температуре (до -20°С).

Полученную сыворотку иснользовали ири закладке опыта со следующими вариантам и:

1.Контроль - без обработки.

2.Контроль - чистая вода.

3.Контроль - гетерогенные белки (белых крыс).

4.Вариант с антигемоцитарной сывороткой.

5.Энто.маиатогенными бактериями Вас. thuringiensis.

6.Антигемоцитарная сыворотка и эито.моиатогенные бактершь

Варианты с контролями и антигемоцитарной сывороткой осуществляли посредством опрыскивания ио поверхности тела гусениц, а вариант с энтомопатогенными бактериями осуществляли дополнительной дачей в корм гусеницам энтомоиатогенных бактерий Вас. thuringiensis cereus Var. galleria из расчета 0,016 мл суспензии в 0,1% концентрации раствора на одну гусеницу, содержащей около 200000 спор бактерий.

Кроме того, все варианты опыта были noBTopeiibi с дозами антигемоцитарной сыворотки 0,25 мкл и 2,50 мкл из расчета на 1 гусеницу и второго и щестого возрастов гусениц.

Результаты испытаний изложены в табл. 1 (гибель гусениц в % до 36 ч).

Таблица 1

Все варианты проверки были исполнены F, пятикратной новторности, а в каждой повторности было использовано 100 гусеииц. В связи с тем, что иммунитет передается по наследству, была проведена повторная 45 проверка с гусеницами Galleria mellonella L., второго поколения полученного от бабочек, выживших от первой проверки. Результаты испытаний изложены в табл. 2 (гибель гусениц в % до 36 ч).

Комиссия считает, что гусеницы после 48 ч воздействия на них бактериями нриобретают иммунитет иротив них.

Соиоставление первой и второй таблиц (первое и второе поколения) показывает, что при воздействии на гусениц одними только энтомопатогенными бактериями способствует приобретению гусеницами стойкого иммунитета против указанных бактерий.

Воздействие же на гусениц антигемоциХимические средства

Уничтожают насекомых посредством отравления их организмов

Прнмененне хнмнческнх средств вызывает адаптацию насекомых к ним

Вызывает отравление окружающей среды Токсичный для теплокровных

Формула изобретения

Способ подавления иммунитета к энтомоиатогеиным бактериям у насекомых, отличающийся тем, что, с целью иовышеТаблица 2

тарной сывороткой способствует полному подавлению иммунитета у гусениц против энтомопатогенных бактерий и 100%-ной гибели вредных насекомых во втором поколении.

По данным заявителя, по сравнению с существующнми химическими средствами борьбы с вредными насекомыми использование природных факторов - подавление иммунитета насекомых - имеет следующие преимуидества:

Подавление ил1мунитета

Уничтожают насекомых посредством подавления их иммунитета

Применение антнгемонитарной сыворотки вызывает наследуемое снижение устойчивости к бактериям

Для окружающей среды безвреден

Узкоснецифичный н действует только на тот вид насекомых, против которого их применяют

ния эффективности борьбы с насекомыми и предотвращения загрязнения окружающей среды, в качестве активного вещества берут антигемоцитарную сыворотку насекомых.