Способ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве Советский патент 1979 года по МПК G01N31/08 

Пример 1. Берут 2,5 г воздушно-сухой почвы, освобожденной от растительных корней и просеянной через сито с отверстиями 1 мм, и экстрагируют ее 20 мл 0,7 н. iNaOH при 65°С в течение 25 ч. Щелочной экстракт (15 мл), охлажденный до О-5°С, нейтрализуют концентрированной НС1 и подкисляют до рН 1,1. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, промывают охлажденной 0,1 н. НС1 и оставляют на 24 ч при 37°С с 20 мл 0,1 п. НС1. Жидкость объемом 15 мл упаривают на водяной бане, сухой материал растворяют в нескольких каплях 0,1 н. НС1 и количественно переносят на хроматографическую бумагу в виде полосы. Разделение оснований проводят в системе растворителей метанол : концентрированная НС1: :вода (70:20:10) в течение 25-27 ч (нисходящая хроматография). Обнаруженные при просмотре в ультрафиолете пятна оснований элюируют 5 мл 0,1 н. НС1 (37°С, 12 ч) и спектрофотометрируют против элюента в прямоугольных кварцевых кюветах (ширина 1 см) при следующих длинах волн: аденин- при 228, 260 и 290 нм, гуанин- при 224, 250 и 290 нм. Расчет количества оснований производят но следующим формулам

Д --. - (228 - 29 о) А OQQ I ,82

р (224 + 29o) А 71 А

где А и Г - количества аденина и гуанина в ммоль/5 мл элюата соответственно;

D -величина оптической плотности при длине волны Я; 0,399 и 0,714 - коэффициенты для пересчета величин оптической плотности в размерности концентрации;

1,82 и 2,00 - константы, характеризующие спектр поглощения аденина и гуанина соответственно.

Содержание ДНК в почве рассчитывают по формуле

Г (А + Г)п2100

О - ,

а

где С - содержание ДНК в почве в ммоль оснований/100 г почвы;

п - разведения, произведенные в ходе

анализа;

а - навеска почвы, г;

АиГ - количества аденина и гуанина в ммоль/5 мл элюата.

В итоге получают содержание ДНК в дерново-нодзолистой почве, равное 30,0 ммоль оснований/100 г почвы.

Пример 2. Берут 2,5 г почвы и экстрагируют ее 20 мл 0,65 н NaOH при 60°С в течение 25 ч. Остальные операции и расчеты производят но примеру 1. Получают выход ДНК для дерново-подзолистой почвы, равный 29,6 ммоль оснований/100 г почвы.

Пример 3. Экстракцию ДНК из почвы с последующим ее осаждением кислотой проводят по примеру 1, затем осадок гуминовых кислот, содержащий ДНК, дважды промывают охлажденной 0,1 н. НС1 и оставляют на 30 ч нри 40°С с 20 мл 0,1 н. НС1. Далее анализ осуществляют но примеру 1 и получают содержание ДНК в дерновоподзолистой почве, равное 30,9 ммоль оснований/100 г почвы.

Иснользованне предлагаемого способа имеет следующие преимущества по сравнению с известными: ускорение процесса и повышение его точности.

Формула изобретения

Снособ количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты в почве путем экстракции ее из навески почвы щелочью, осаждения соляной кислотой с последующим кислотным гидролизом и выделением образовавшихся азотистых оснований бумажной хроматографией, отличаю щ и и с я тем, что, с целью сокращения времени анализа и повышения точности способа, щелочную экстракцию осуществляют 0,65-0,75 н. гндроокисью натрия нри 60- 70°С, кислотный гидролиз ведут 0,1 н. соляной кислотой при 37-40°С в течение 24-30 ч, выделяют аденин и гуанин путем хроматографии на бумаге и по их количеству судят о содержании дезоксирибонуклеиновой кислоты.