Способ получения -галактозидазы Советский патент 1980 года по МПК A61K38/46 

Механизм активадии п стабилизации струКтурьГ р-галактозидазы 8-меркаптохинолинЬм закл1Вчается в защите сульфгидрильных цйстёиновых групп активного центра фермента от ъйисления благодаря нали- 5 чию SH-группы в молекуле 8-меркаитохинолина.

Хелатные свойства 8-меркаптохинолина одновременно обеспечивают предотвращение инактивации фермента ионами тяжелых ю металлов, которые связываются 8-меркаптохинолином с образованием комплексной соли.

Согласно изобретению описывается способ получения р-галактозидазы из клеток i5 дрожжей Saccharomyces fragilis путем экстракции фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждения, которые осуществляют в присутствии 8-меркаптохинолина при концентрации (2,5-5) 10- моль/л.SO

Описываемый способ обеспечивает выход галактозидазы 74-88% и с удельной активностью 7,4-11,3 ед/мг белка.

Пример 1. 100 г дрожжей Sacch. fragilis суспендируют в 1 л 0,001 н. фосфатного 25 буфера рН 6,9 с добавлением 8-меркаптохинолина 2,5-10 моль/л. Экстракцию проводят в течение 6 ч при 30°С. Затем суспензию центрифугируют, р-галактозидазу из осветленного экстракта осаждают суль- 3J фатом аммония (40-60% насыщения). Осадок суспендируют в 50 мл того же буфера и добавляют глицерин (50%). Препарат хранят в виде суспензии в глицерине. Активность 7,4 ед/мг белка. Выход 74%. зо

Пример 2. Экстракт приготавливают по примеру 1. Коицентрацня 8-меркаптохиноина в буфере - 3,0-10 моль/л. р-Галакозидазу из осветленного экстракта осажают 4 объемами этилового спирта при 40 6°С. Осадок суспендируют в 100 мл того же буфера, содержащего 8-MepKamiOXHHOин с концентрацией З-Ю- моль/л. Хранят 50%-ном растворе глицерина. Активность ,1 ед/мг белка. Выход 84%.45

Пример 3. Приготовление экстракта и осаждение ведут диалогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина 5-10 мрль/л. АКТИВНОСТЬ 9,3 ед./мг белка. Выход 87%.

Пример 4. Приготовление экстракта и осаждение осуществляют аналогично примеру 2, концентрация 8-меркаптохинолина - 2, моль/л. Активность 8,2 ед/мг белка. Выход 79%.

Пример 5. 100 г дрожжей Sacch. fragiiis экстрагируют в присутствии 1 л фосфатного буфера рН 6,9 с добавлением 2,510-4 моль/л меркаптохинолина в течение 20 ч при 5°С. Экстракт центрифугируют, недостаточную жидкость концентрируют на ультрафильтрационной ячейке через ацетатцеллюлозные мембраны УАМ-200 в 10 раз (давление - 3 атм, температура- 4-5°С) 100 мл коицентрата промывают 3 раза по 1 объему того же буфера с меркаптохинолином (2,). Активность 11,3 ед/мг белка. Выход 75%. Хранят в 50%-ном глицерине.

Формула изобретения

Способ получения р-галактозидазы из клеток дрожжей Saccharomyces fragilis, включающий экстракцию фермента буферным раствором рН 6,9 и осаждение, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода и удельной активности целевого иродукта, экстракцию и осаждение проводят в присутствии 8-меркаптохинолина при коицеитрации (2,5-5) 10- моль/л. Источники ииформации,

прииятые во внимание при экспертизе

1.Авторское свидетельство СССР № 480759, кл. С 12D 13/10, 1972.

2.Фениксова Р. В. и др. Получение препаратов р-галактозидазы из дрожжей Sacchar. fragilis. - «Прикладная биохимия и микробиология, т. 7, вып. I, 1971, с. 34, (прототип).