Способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз Советский патент 1980 года по МПК A61K38/46 

(54) СПСХЗОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕАЗ исходного сырья (сефарозы и микробные ингибиторы сериновых протеаз в Советском Союзе не производятся), многостадийность приготовления сорбента. Целью изобретения является увеличение.селективности сорбции сериновых протеаз. Поставленная цель достигается путем использования природного полисахарида-хитина, который после предварительнрго измельчения деминерализуют 3-6 к. |НС2: и отмьгоают водой. Предлагается способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз, заключающийся в том, что природный полисахарид-хитин измельчают отбирают фракцию с диаметром частиц О,,4 мм, обрабатывают 3-6 н. НС и промьшают водой до нейтрального зна чейия рН. Для приготовления сорбента прбд;7агаемым способом употребляют широкораспространенный природный хитин. В С ветском Союзе хитин получают в больших количествах как отход производства до .настоящего веремени он не находил широкого практического применения. Полученный сорбент является стабильным как механически, так и химически. На нем можно проводить неограниченное число операций очистки сериновых про- теаз. При очистке сериновых протеаз на сорбенте, приготовленном согласно изобретению, удельная протеолитическая активность сериновых протеаз из Вас. sula tikis увеличивается 4-5 раза, а активность оС -химотрипсина и трипсина - в 2-,5 разаза одну операцию сорбциидесорбции. Благодаря легкой доступности хитина простоте приготовления и долговечности в работе сорбента и благодаря достигае мому положительному эффекту при его и пользовании предлагаемый способ являет ся перспективным, .дешевым .для примене ния в крупномасштабном производстве. Предлагаемый способ приготовления хитина позволяет повысить сорбционную емкость сериновых протеаз, при этом удельная активность сериновых протеаз за одну стадию сорбции-десорбции повышается в 4-5 раз. Выходы по белку и активности составляют 8О-1ОО%. По сущности процесса сорбции сери ювых протеаз ирш-отовленный предлагае мым способом хитин является а})финньгм сорбентом. Пример 1. Обработка хитина. Хитин (ч.МРТУ 6-О9-5 113-68) измельчают, просеивают через набор сит, отбирают фракции с размером частиц 0,3 мм, обрабатьгоают при комнатной температуре 6 н. НСв до прекращения выделения СО..- , перемешивая механической мешалкой. Смесь фильтруют через стеклянный фильтр, промьгеают 6 н. НС, а затеммногократно дистиллированной водой, теплыми (50°С) 1%-ными растворами NoC2 и СН„ СООН, дистиллированной водой. П р и м е р 2. Выделение и очистка микробных сериновых протеаз. 6 г хитина, приготовленного, как описано в примере 1, загружают в колонку (1,5x20 см), уравновешенную 0,01М универсальным буфером рН 7,5, и наносят 4 мл раствора ферментного препарата протосубтилина ГЮх, полученного из Вас. диЪ11 13 в том же буфере рН 7,5. Концентрация белка 3,О мг/мл, общая удельная протеолити- ческая активность 1,3 ед/мг белка при рН 7,5 и 0,625 ед/мг белка при рН 9,5 (активность сериновых протеаз соответственно 0,24 ед/мг белка при.рН 7,5 и 0,22 ед/мг белка при рН 9,5). Протеолитическую активность во всех случаях определяют модифицированным методом Ансона Активность сериновых протеаз .Вас. subtitis в протосубтилине ГЮх определяют после обработки раствора ферментного препарата 0,О 1 М раствором ЭДТА, концентрацию белка - методом Лоури. При элюции 100 мл указанного буфера вымываютчзя металлопротеазы, цротеолитически неактивные белки и краcsuune вещества. Сериновые протеазы элюируются при повышении ионной силы линейн 11м градиентом хюристого натрия от О,О1 до 1,ОМ (по -ЮО мл) в том же буфере рН 7,5. Удельная протеолитическая активность сериновых протеаз после элюции - 1,28 ед/мг белка при рН 7,5 и 1,12 еп/мг белка при рН 9,5. Пример 3. Выделение и очистка сериновых протеаз животного происхождения. 2 мл раствора с( -химотрипсина (марка А, ТУ 6-О9-646-7 I, Олайнский завод химреактивов) в 0,0 1 М универсальном буфере рН 7,5, содержащего 34 мг/мл белка с удельной протеолитической активностью по казеинату натрия 1.4 ед/мг белка, наносят на колонку.

описанную в примере 2. При элюции 150 мл указанного буфера вымываются протеолитически неактивные белки. Л -Хиотрлпсия элюируется при повышении ионной силы элюирующего раствора, ана- логично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельная протеолитическая активность ос -химотрипсина после элюции 2,7 ед/мг белка.

Пример 4. 4 мл раствора трипсина (марка В, Олайнский завод химреактивов) в 0,0 1 М универсальном буфере рН 7,5 наносят на колонку , описанную в примере 2. Концентрация белка 18 мг/мл, удельная протеолитическая активность трипсина по казеинату натрия 0,9 ед/мг белка. При элюции 15О мл указанного буфера вымываются протеолитически неактивные белки. Трипсин элюируется при повышении ионной сипы элюи руюшего раствора аналогично примеру 2 в том же буфере рН 7,5. Удельная протеолитическая активность трипсина после элюции - 2,1 ед/мг белка.

Формула изобретения

Способ получения сорбента для выделения и очистки сериновых протеаз на основе природного полисахарида, отличающийся тем, что, с целью увеличения селективности сорбции природный полисахарид - хитин измельчают, отбирают фракцию с диаметром частиц О,3-О,4 мм, обрабатьгоают 3-6 н. соляной кислотой с последующим промывани водой до нейтрального значения рН.

Источники информации, принятые во внимание при экспертиза

1. Патент США № 3331751, кл. 195-62, опублик. 1967.

2; LaveC.R.,Dean P.D.G. Affinilv chro. otpg P it-Of 3orrr, 134, 1974.

3.«S.SGto, S.Muroo. Preparation of 1mmcsbjtized Protease iMhibiior (s-sj) and application to Ensvme ourii AgK B«ot Chem.39,2« 415, 1975 (прототип;.