Способ получения сорбента дляВыдЕлЕНия и ОчиСТКи СЕРиНОВыХпРОТЕАз Советский патент 1981 года по МПК C08B37/08 

1

Изобретение относигся к энзимологии и прецназначено для создания высокоэффективных и крупномаси1табных способов получения высокоочищенных трипсино- и химотрипсиноподобных сериновых протеаз различного происхождения.

Для выделения и очистки сериновых протеаз известен ряд ионообменных и биосаецифических сорбентов. В качестве ионообменных сорбентйв чаще всего используют ионообменные целлюлозы .

Однако сорбенты данного типа обладают низкой степенью селективности в отношении очищаемого фермента, вследствие чего они ариемлемы, как правило, только в качестве составных стаций общих схем очистки ферментов.

Более эффективным методом выделения и очистки ферментов является биоафинная хроматография с использованием биоспе- цифических сорбентов. Однако сорбенты, получаемые в основном с использованием агарозных матриц и синтетических ила природных ингибиторов сериновых протеаз

2 -Л: VV - V

и исполЕззуемые для очистки фермен-рч т-... являются малопригодными для их применения в препаративных масштабных из-за дороговизны их получения и низкой стабильности к механическим, химическим и микробиологическим воздействиям.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбента бензильного агарозногогеля, сшитого 2,3-дибромпропанолом, используемого для гидрофобной высаливающей хроматографии ряда.ферментов, в том числе и трипсино- и химотрипсиноподобных сери - новых протеаз. Спосбб получения сорбента включает стадии отмывки сефарозного геля 2В водой, его сшивки 2,3-дибромпропанолом в 5 М растворе едкого натрия, в присутствии 1% боргкаркаа натрия при комнатной температуре в течение 2,5 ч с последующей промывкой геля водой, этанолом, водой, с последующим О-бензилированием хлористым бензилом в 1-5 N растворе NaOH в присутствии боргидрида натрия при в течение 37 5 ч. В зависимости or концентрации N аОН получают гели с содержанием от 900-2500 мкм бензильных остатков не 1 г сорбента Г2. Однако существующий способ получения бензильного сефарозного геля для хроматографии сериновых протеаз обладает рядом существенных недостатков; 1.Исходная матрица, используемая для получения сорбента, является дорогостоящей,, низкосгабильной к действию ме ханическкх и химических факторов и легк подвергается воздействию микроорганизмов, вследствие чего ограничивается или полностью исключается возможность испо льзования сорбентов, полученных на ее основе для крупномасштабного выделения Я очистки ферментов. 2.Используемый.- в качестве лиганда сорбента бензильньй остаток, исходя из данных, о субстратной специфичности сериновых протеаз, лишь в некоторой степени обладает сродством к сериновым прогеазам химотрипсинового типа, и совсем непригоден в качестве лиганда для сорбентов, предназначенных для очистки трипсиноподобных сериновых протеаз. 3.Существующий способ получения бензильного производного агарозы не позволяет ввести в матрицу бензильных остатков менее 900 мкм/г сорбента. Та кая высокая плотность бензильных радик лов в сорбенте отрицательно отражается на эффе гивной:работоспособности данного сорбента в процессе сорбции-десорбци трипсина и химотрипсина - эффект очистки ферментов практически отсутствует,, так как сорбент прочно удерживает достаточно высокое количество посторонних белков. В пользу этого свидетельствуют низкие выходы по активному белку (4О55%), которые резко снижаются вплоть До при увеличении концентрации вводимых бензипьныХостатков. Таким образом, существующий способ бензипирования полисахаридных матриц ПРИВОДИТ к получению сорбентов с явно выраженной неспецифической сорбцией ферментов, в том числе и сериновых про теаз. Цель изобретения - получение сорбента с повышенной селективностью сорбции трипсино- к химотриасиноподобных серийных протеаз. Поставленная цель достигается тем, что в качестве исходного полисахарида используют хитин, который предварительно обрабатывают 3, соляной кнслотой до прекращения вьюеления С.О,, 9 промывают водой до нейтрального знаения рН, ацетоном, высушивают предпочтительно при и подвергают К-бензилированию хлористым бензнлом при молярном соотношении 2,0-3,0 моля хлористого бензила на 1 моль первичных аминогрупп хитина в среде абсолютного диоксана с метанолом при объемном соотношении последних 6:1, соответственно, в присутствии безводного йодистого натрия 0,5 молей и двууглекислого натрия 1,5-2,0 моля на 1 моль хлористого бензила в течение 15-20 ч при температуре 50-6О С и последующей промывкой сорбента последовательно диоксаном, ацетоном и водой. Предлагаемые условия бензилирования хитина обеспечивают, протекание реакции по аминогруппам хитина {60-90 мкм/г) и в значительной степени снижают возможность присоединения бензильных остатков по гидроксильным группам носителя, причем бензилирование хитина происходит в условиях, обеспечивающих сохранение в хитине связи между его полисахаридной и белковой частью, ответственной, в качестве одного из сорбционных центров, за избирательностьсорбции сериновых протеаз. Для синтеза сорбента и его применения для выделения, разделения и очистки сериновых протеаз из различных источников используют лабораторную аппаратуру для синтеза сорбентов, хромагографические колонки, ФЭК-60, СФ-16. Пример 1. Синтез сорбента осуществляют следующим образом. Хитин (ч. МРГУ 6-О9-5113-63) измельчают, просеивают через набор сит,отбирают фракции хитина с размером часгиц О,3 мм, обрабатывают, при комнатйой температуре 6Ы НСб до прекращения выделения СО2 , перемешивая мехакГической мешалксй. Смесь фильтруют через сгекл5шный фильтр, промывают фильтратом, фильтруют операцию повторяют 5-8 раз), промывают 6N НСб, затем большим количеством дистиллированной водой до нейтрального значения рН, ацетоном, сушат при 1ОО-1О5 С. В сухом хитине определяют содержание свободных аминогрупп методом образования шиЛфовых оснований с салициловым альдегидом. 1 г хитина содержит 60 мкм свободных аминогрупп. Все количества остальных реагентов высчитывают на I моль аминогрупп. На синтез сорбента берут 15 г хнтина, количество свободных аминогрупп, в котором составляет моль. В трехгорловой круглодонной колбе, соединенной с обратным холодильником, механической мешалкой, термометром со сходящим вниз шлифом и с хлоркальциевой трубкой, в 33 мл метанола () растворяют 0,135 г (0,0009 М) безводно го МаЗ , прибавляют 167 мл абсолютного диоксана (общий объем растворителей 200 мл), 0,228 г (0,ОО18 М) бензила хлористого, 0,227 г (О,О027 М) натрия двууглекислого и 15 г сухого хитина. Смесь перемешивают в течение iS20 ч, нагревая на водяной бане при.тем пературе реакционной смеси 5О-60С, По окончании реакции сорбент на стеклян ном фильтре промывают абсолютным диок саном, ацетоном 2-3 раза (для удаления ), фильтрат отбрасывают и сорбент тщательно промывают водой (для удаления NaC6 ). Фильтрат и промывные воды переносят в мерную колбу на lOO мп, объем доводят до метки и в нем определяют содержание ионов С6 титрованием с индикатором У1 () Параллельно определяют число введеинърс бензильных групп по оставшимся свободным аминогруппам в полученном высушенном сорбенте (с салициловым альдегидом). П р и М е р 2. Выделение и очистку трипсина и химотрипсина из медицинского панкреатина осуществляют следующим образом. Колонку (1,7 X 31 см), наполненную 1О,63 г h/ -бензилхитина, уравновешиваю О,О02 М раствором Са (CHjCOOjgpH 7,0 и вносят 50 мл раствора медицинского панкреатина в 0,002 М Са (СНаСОО)2 рН 7,0 с концентрацией белка 2,6 мг/мл, с общей протеолити- ческой активностью 0,15 казеиновых еди ниц на 1 мг белка (каз. ед/мг). Скорос течения элюента 40 мл/ч. После нанесения раствора медицинскогопанкреатина, колонку промывают начальным буфером (0,002 М Са (СН СОО)2 рН 7,0) до отрицательной реакции на белок. После чего через колонку пропускают 0,5 М раствор НаСев 0,002 М Са (СНзСОО) рН 7,0 до отрицательной реакции на белок (около ЮО мл). Фракция с протеолнтической активностью собирают, общий обьем 60 мл, концентрация белка с 0,87 мг/мл, получают 52,2 мг трипсина с активностью 0,1О каз.ед/мг: белка., После отделения трипсина через колонку пропускают 1,5 М раствор NaC6 в 0,ОО2 М Са (СНзСОО)2 до отрицательной реакции на белок (около 10О мл), Фракции с протеолитической активностью объединяют: 60 мл с концентрацией белка 0,76 мг/мл, получают 45,6 мг OG -химотрипсина с активностью 0,08 каз.ед/ /мг белка. . После диализа фракции с трипсином и с об -хипотрипсином лиофильно высушивают. На 1 г медицинского панкреатина получают 28,0 мг трипсина, содержащего 85-90% белка. Активность препарата 0,09 каз. ед/мг белка, что соответствует 67 ед. БАЭЭ/мг белка (N - бензоил- DL-аргинин этиловый эфир). И 1 г медицинского панкреатина кроме трипсина получают 23 мг сх - -химотрипсина. Активность препарата 0,08 каз. ед/мг белка. Он гомся екен но методу электрофореза в попиакриламидн Му( геле. П р и М е р 3. Выделение и очистка трипе и химотрипсина из препарата трипсина марки Б (ОЗХР). 100 мг трипсина марки Б с активиостью 16 еД БАЭЭ растворяют в 25 лл 0,002 М Са (CHjCOO) рН 7,0, фильтруют и вносят в колонку, наполненную 1О,63 г М -бензилхитина, (1,7 х 31см) и предварительно уравновешенную 0,002 М Са () рН 7,О. Скорость течения элюента 40 мл/ ч. После нанесения раствора трипсина на.колонку, ее промывают тем же раствором 0,ОО2М Са (СНзСОО)2 рН 7,0 до отрицательной реакции на белок. После чего через колонку пропускают О,5 М раствор NoiCB в 0,ОО2 М Са (CHjCOO). рН 7, О до отрицательной реакции на белок (около 1ОО мл). Фракдни с протеолитической активносгыо собирают и после диализа лиофильно высушивают. Получают 20 мг трипсина с активностью 75 ед. БАЭЭ/мг белка. Степень очистки 4,6 раза. После отделения трипсина через коонку пропускают 1,5 М раствор НаСК О,О02 М Са (CHgCOO) ipH7,o до трицательной реакции на белок. Так как репарат трипсина марки Б (ОЗХР) содерит незначительное количество о6-химо-, рипсина (примерно 6-11%), то для лиоильного высушивания такое количество едостаточно (из ЮО мг препарата). оэтому собирают фракции с с6 -химотркпсином после нескольких хроматограмм и тогда большее количество после диализа лиофипьно высушивают. Предлагаемьй способ получения сорбента на основе полисахарида хитина) путем его N -бензилирования позволяет вводить в хнтин от 60-9О мкм/г бензильных остатков, являющихся вторым селективным сс бцисбшым центром сорбента, вследствие чего сорбент обладает выссжой специфической одновременной со бцией сгрсягой селективностью десорбции, с высокими степенью очистки и выходом по активности трипсино- и химотрипсиновых сериновых протеаа непосредственн из сырых экстрактов различных источников ферментов. Формула изобретения 1. Способполучения сорбента, для выделения и очистки сериновых протеаз, включающий обработку полисахарида хлсф стым бензилом, отличающийся тем, что, с целью повышения селективносги сорбции, в качестве полисахарида исйользуют Хитин, который предваритель но обрабатывают 3-6 М соляной кислотой до прекращения вьшеления COj, промыва ЮТ водой до нейтрального рН и затем высушивают ацетоном, а обработку хлористым бензилом осуществляют при молярном соотношении хлористого бензила и первичных аминогрупп хитина, равном 2-3 : 1, в среде абсолютного диоксана и метанола при обьемном соотношении последних 6:1, соответственно, в присутствии 0,5 молей безводного йодистого натрия и 1,5-2 молей двууглекислого натрия на 1 моль хлористого бензила в течение 15-2О ч при 50-60 С с последующей промывкой полученного сорбента последовательно дисксаном, ацетоном, водой. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что хитин высушивают 1ри . Источники информации, принятые во внимание при экспертизе .C|Osh Uo Narahashi,kaoru Qodd, A&kaBine беНпе proteinases О and t oi streptomyces gr seusU-l,J. Вчоchem.l977,v,81,p.58T-Tg. 2.Topgny Laas,Agar (derivatives ior chromafography,eSecirophores-is and eBbound еп2.,,С,Ьго maiorg.l9T6,v-in,№2,p3T3-3e7 (прототип).