Способ выделения и очистки трипсина и химотрипсина Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 G01N31/08 

(54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ ТРИПСИНА Изобретение относится к области энзимологаи и родственным ей областям науки и промышленности, использующим высокоочищенные ферменть. Высокорчищенные трипсин и химотрипсин могут быть использованы в фармацевтической, медицинской и пищевой промышленности, а также в ряде областей науки - молек лярной биологии, биохимии и т. д. Б современно знзимологйи для выделения и очистки трипсина и Химотрипсина весьма успешно применяется метод биоаффинной хроматографии с использованием биоспецифических сорбентов, полученных на основе синтетических или природных ингибиторов указанньтх фермен тов. . Однако биоспёцифические сорбенты, получен ные на основе специфических синтетических низкомолекулярных ингибиторов трипсина и Химотрипсина, являются пригодными для раздельной очистки данных ферментов, и лишь в отдельнь1х случаяхдостигается одновременное разделение и очистка трипсина и Химотрипсина, и то при условии использования предварительно очищенных ферментных препаратов ,(1 . И ХИМОТРИПСИНА С другой стороны, биоспецифические сорбенты, полученнь1е на основе природных ингибиторов трипсина, позволяют проводить одновременный процесс выделения и очистки трипсина и Химотрипсина непосредственно из:сырых экстрактов, но возможность применения таких сорбентов в препаративных масштабах ограничивается в связи с дороговизной их получения и низкой устойчивостью к химическим и микробиологическим воздействиям.. Известен способ очистки частично очищенных препаратов рипшна и химотрипсина гидрофобнрй вь1сагшвающей хроматографией на бензилагарозе, заключающийся в сорбции ферментов в 0,1 М цитратном буфере i рН 3,0, содержащем 3 М NaCI и десорбции ферментов градиентной люцией градиентом NaCI в концентрации 3,0 М в исходном буфере или линейным градиезгтом от исходного буфера с 3 М NaGI до исходного буфера с 50% зтиленгликоля 2. Однако существующий способ обладает следу-ющими недостатками: 1) исходная матрица,используемая для синтеза сорбента сефароза, дорогостоящий, низко37стабильный к действию химических реагентов, JKTKO подвергаемый действию микроорганиимов материал-; 2)в таких условиях проведения хроматографии трипсина или химотрипсина на бензилагарозе с содержанием бензильных групп 900 мк М/г носителя наблюдается незначительное повыигение удельной активности десорбируемото фермента (для трипсина от 0,90 ед/мг до 1,3 ед/мг, для химотрипсина от 970 ед/мг до 1100 ед/мг) в 1,2-1,4 раза, при этом выход активного фермента составляет всего лишь 40-55% 3)в указанных условиях проведения хроматографии даже наличие таких агентов, как 3 М МаС| или 50% этиленгликоль не обеспечивает количественных выходов десорбции посторонних белков, что может привести к постепенному загрязнению колонки с сорбентом и трудности его регенерации; 4)отсутствуют какие-либо данные о возмож ности выделения и очистки трипсина и Химотрипсина непосредственно из сырых экстрактов и возможности поочередной десорбции ферментов при их совместной .сорбции на сорбенте. Целью предлагаемого изобре тения является повышение выхода и степени очистки целевых ферментов и упрощение процесса их выделения и очистки. Поставленная цель достигается, согласно изо ретению, описываемым способом выделения и очистки трипсина и химотрипсина, включающим сорбцию ферментов в 0,002-0,005 М ацетат е кальция при рН 6,9-7,1 на сорбенте, в качестве которого используют N-бензилхитин с кондантрацией бензильных групп 60-90 мк М/г и десорбцию, причем для десорбции трипсина используют 0,5Ч),6 М раствор NaCI в исходном буфере, а для десорбции химотрипсина 1,5-2,0 раствор NaCI в исходном буфере. Существенными отличиями описываемого аюсоба являются использование в качестве сор бента N-бензилхитина с концентрацией беизильных групп 60-90 мк М/г, использование при сорбции 0,002-0,005 М ацетата кальция, рН 6,9-7,1, использование для десорбции трипсина0,,6 М раствора NaCI в исходном буфере, а для десорбции химотрипсина - 1,5-2,0 М раствора NaCI в исходном буфере. Преимущество предлагаемого способа заключается в том, что процесс сорбции - десорбции ферментов на бензилхитине осуществляется в мягких.условиях,, обеспешвающих высокую степень сохрайения активности и очистки ферментов за счет наличия в сорбенте двух сорбционных центров (бензильных групп и белковой части хитина), способных к строго селективному взаимодействию с целевыми ферментами, тогда как в известном способе сорбция ферментов реализуется на бензильйых остатках Л за счет действия неспецифических гияр(х{)об11ых Лл связывания. Эти особенности N-бензилхигина определяют условия проведения всего процесса хроматографии ферментов, что выражается и в том, что оба фермента десорбируются при достаточно различающихся концентрациях солей в буферном растворе (как при хроматографии неочищенного нанкреатина, так и при хроматографии частично очищенных препаратов трипсина и химотрипсина) , в результате чего достигается значительное повышение удельной активности трипсина (от 3 до 5 раз), химотрипсин достигает электро- , форетически гомогенного состояния. Выход активных ферментов составляет не менее 70-80%. Пример 1. Выделение и очистка трипсина и химотрипсина из медицинского панкреатина... Колонку (1,1x31 см), наполненную 10,63 г N-бензилхитина, уравновещивают 0,002 М растврррм Са(СНзСОО)2 рН 7,0 и наносят 50 мл IMCTBOpa медицинского панкреатина в 0,002 М Са(СНзСОО)2 рН 7,0 концентрацией белка 2,6 мг/мл общей протеолитической активностью 0,15 казеиновых единиц на 1 мг белка (каз. ед/мг). Скорость течения элюента 40 мл/ч. После нанесения раствора медиданского панкреатина колонку промывают начальным буфером (0,002 М Са(СНзСОО)2рН 7,0) до отрицательной реакции на белок. После чего через колонку пропускают 0,5 М раствор NaCI в 0,002 М Са(СНзСОО)2 рН 7,0 до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции с протеолитической активностью собирают, общий объем 60 мл, концентрация белка 0,87 мг/мл, получают 52,2 мг трипсина с активностью 0,10 каз. ед/мг белка. После отделения трипсина через колонку пропускают 1,5 М раствор NaCI в 0,002 М Са(СНзСОО)2 до отрицательной реакции на белок (около 100 мл). Фракции ,с протеолитичгской активностью объединяют: 60 мл с концентрацией белка 0,76 мг/мл, получают 45,6 мг а -химотрипсина с активностью 0,08 каз. ед/мг белка. После диализа фракции с трипсином и с а -химотрипсином лиофильно высушивают. Из 1 г медицинского панкреатина получают 28,0 мг трипсина, содержащего 85-90% белка. Активность препарата 0,09 каз. ед/мг белка, что соответствует 67 ед. БАЭЭ/мг белка . (N-бензоил-DL-аргининэтиловый эфир). Из 1 г медицинского панкреатина, кроме трипсина, получают 23 мг химотрипсина. Активность препарата 0,08 каз. ед/мг белка; Гомогенность устанавливают методом электрофореза в полиак рилами дном геле.