Способ очистки протеиназ цистеинового типа Советский патент 1988 года по МПК C12N9/00 C12N9/50 

113

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеино- .вого типа из растений.

Цель изобретения - упрощение процесса.

Изобретение заключается в том, чт в способе очистки протеиназ цистеино вого типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефарозу, модифицированную иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно -связанные ионы ртути, а элюцию вести фосфатным буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaCl при рН 6,5-7,5.

Принципиальным отличием предлагаемого сорбента является то, что сорбирование происходит за счет ионо ртути, координационно связанных с поверхностью сорбента, а не ковалент- но связанньгх с ним. Это позволяет осуществлять элюцию сорбированного белка в более мягких условиях.

Способ осуществляют следующим образом.

Очистке подвергают препараты ферментов, полученные из латекса дынного дерева Carica papaya или растений рода Ficus. Сорбент получают кова- леитным присоединением к эпоксипро- изводному сефарозы иминодиуксусной кислоты при 65 С в течение 24 ч. На- сьпцение поверхности полученного сорбента осуществляют пропусканием через колонку с сорбентом 1%-ного раствора HgCl. Несорбированные ионы рту

ти отмывают водой. На колонку наносят раствор белка в 0,1 М фосфатном буфере, рН 6,,5. Элюцию ведут тем же буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaCl. При значениях рН меньщих, чем 6,5, не происходит полная сорбция белка, а при значениях выше 7,5 наблюдается неспецифическая сорбция белков. Использование меньших, чем 0,4 М концентраций NaCl приводит к неполной злюции ферментов, а при концентрациях больших 0,6 М элюируются неспецифически сорбированные белки. Достигаемая степень очистки равна 2.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. 140 мг латекса из дынного дерева Carica papaya (отечественный препарат производства Гагрс кого опорного пункта Главного Ботанического сада АН СССР) с активностью

5

5

0

5

Q

5

19 ед/мг белка растворяли в 40 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 6,5 и пропускали через колонку с 6 мл сефарозы, модифицированной иминодиуксусной кислотой, содержащей координационно связанные ионы ртути. После отмывания колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили

элюцию 0,1 М фосфатным буфером, рН 6,5, содержащим 0,4 М NaCl. Получен- рый раствор содержал 36 мг белка с протеолитической активностью 38 ед/мг белка.

П р и М е р 2. 140 мг латекса растворяли в 40 МП 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 и пропускали через колонку с 6 МП сорбента. После отмывания колонки тем же буфером от несорбированного белка проводили элюцию 0,1 М фосфатным буфером, рН 7,5, содержащим 0,6 М NaCl. Полученный раствор содержал 120 мг белка с протеолитической активностью 30 ед/мг белка.

Примерз. Через колонку с 6 мл сорбента пропускали раствор 140 мг латекса в 40 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,0. После отмывания колонки от несорбированного белка осуществляли элюцию сорбированного белка с помощью 0,5 М NaCl в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили 107 мг белкового материала с протео5 литической активностью 38 ед/мг,

Пример4. 50 мг фицина (препарат латекса растений рода Ficus, Calb iochem) растворяли в 30 мл 0,1 М фосфатного буфера и пропускали через колонку с сорбентом. После промывания колонки белковый материал элюи- ровали 0,5 М NaCl в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,0. Получили 7 мг фицина, активность которого соответствует 40 ед/мг, что в 2 раза превышает активность исходного препарата.

Как видно из представленных примеров , оптимальными условиями для элюции цистеиновых протеиназ с поверхности сорбента являются 0,1 М фосфатный буфер, рН 7,0, содержащий 0,5 М NaCl. В результате полученные препараты ферментов латекса и фицин имеют активность 38 и 40 ед/мг соответственно. Таким образом, применение более простого сорбента, содержащего на своей поверхности координационно связанные ионы ртути, позволяет применять для элюции сорби0

рованных протеинаэ простой способ, заключающийся в промывании сорбента фосфатным буфером, содержащим NaCl.

Способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ, так как отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождаться от них перед очисткой, позволяет осуществлять элюцию более простым способом, т.е. солевым раствором фосфатного буфера, который исключает применение более дорогостоящих («t-цистеин и -меркаптоэтанол) и вредных (й-меркаптоэтанол) реактивов более дешевьш и безвредным (хлористый натрий), а также увеличить

производительность за счет высокой емкости сорбента.

Формула изобретения

Способ очистки протеиназ цистеи- нового типа, предусматривающий аффинную хроматографию на сорбенте на основе сефарозы, содержащем ионы lig , с последующей элюцией, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, в качестве сорбента используют сефарозу, модифицированную

иминодиуксусной кислотой, содержащую координационно связанные ионы Hg, элюцию ведут фосфатным буфером, содержащим 0,4-0,6 М NaCl, а рН буферного раствора устанавливают 6,5-7,5.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способам очистки протеолитических ферментов цистеино- вого типа из растений. С целью упрощения процесса в способе очистки протеиназ цистеинового типа аффинной хроматографией предложено в качестве сорбента использовать сефаро- зу, модифицированную иминодиуксус- ной кислотой, содержащую координационно связанные ионы ртути, а элю- цию вести буферным раствором, содержащим 0,4-0,6 М NaCl, при рН 6,5-7,5. Принципиальным отличием предлагаемого сорбента является то, что, сорбирование происходит за счет ионов ртути, координационно связанных с поверхностью сорбента, а не ковалентно связанных с ним, что позволяет осуществлять злюцию сорбированного белка в более мягких условиях солевым раствором фосфатного буфера, а не дорогостоящими М вредными реактивами, такими как вб -цистеин и Jb -мер- каптоэтанол. Кроме того, способ очистки ферментов на предлагаемом сорбенте дает возможность значительно упростить стадию сорбции протеиназ т.к. отсутствует необходимость обрабатывать ферменты активирующими добавками и освобождаться от них перед очисткой, а также увеличить производительность за счет высокой емкости сорбента. (Л оа sj ю со to