Способ выделения гексокиназы из пекарских дрожжей Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 

фермента уже на начальных стадиях его выделения, что обуславливает крайне низкий выход фермента на последующих стадиях его доочистки. Целью изобретения является повышение выхода фермента и сокращение процесса его выделения. Поставленная цель достигается описываемым способом получения гек сокиназы из пекарских дрожжей, включаюйщм автолиз высушенных дрожжей в О , 2М NanHPO, отделение автолизата, ингибирование протеаз в автолизате обработкой фенилметилсульфофторидом и их отделение,хроматографию полученного в результате ав толизата в Na-фосфатном буфере рН 7 7,5 на сорбенте,представляющем собой аминоэтилцеллюлозу,модифицированную В-0-глюкозой в степени 50-70% от начальной концентрации аминогрупп, с последующей десорбцией фермента градиентом NaCl в концентрации 0,05 1,0 М , в исходном буфере. Существенными отличиями, описьша е мого способа являются осуществление хроматографии автолизата после отделения протеаз в буферном растворе фосфата натрия рН 7,0-7,5 с десорбцией фермента градиентом NaCl в кон центрации 0,05-1,0 М в исходном буфере, а также использование в качестве сорбента аминоэтилцеллюлозы, модифицированной В-0-глюкозой в сте пени 50-70% от начальной концентрации аминогрупп. Oпиcывae ий способ вьзделения дро жевой гексокиназы обеспечивает по срав.нению с существующими способами следующие преимущества: повышение в 2-3 раза выхода активного фермента, что приводит к снижению себестоимости целевого про дукта j -двукратное повышение удельной активности выделяемого фермента, чт приводит к снижению затрат на дальн шие стадии доочистки фермента, -сокращение времени процесса вы деления фермента в два раза, что важно при получении препаративных количеств ферментов в промышленных масштабах. Преимуществом описываемого спосо является также то, что исключаются те стадии очистки фермента, которые обуславливают низкий выход фермента так как по своей сущности они действуют на нативную структуру фермен та, разрушая его. Пример. Способ выделения дрожжевой гексокиназы. Пекарские дрожжи измельчают, высушивают в течение 14 сут, при ком натной температуре. 1,87 г высушенных дрожжей суспендируют в 5,6 мл 0,2 М и автолиэируют при 37°С в течение 2 ч. Полученный экст ракт центрифугируют при 14000 об/мин в течение 20 мин и ингибируют протеазы .прибавлением. 0,09 мл 0,04 М раствора фенилметилсульфофторида в 96%-ном этиловом спирте. Полученный экстракт подогревают до 25-С и оставляют при этой температуре на 30 мин. Диализ экстракта проводят против 0,005М натрийфосфатного буфера рН 7,5 в течение 36 ч. Концентрация белка 25 мг/мл, удельная активность 3 ед/мг. 5 г сорбента загружают в хроматографическую колонку (1,5x20 см), уравновешивают 0,005 М натрийфосфатным буфером рН 7,5 и наносят б,О мл полученного ферментного раствора. Концентрация белка 25 мг/мл, удельная активность 3 ед/мг; При элюции 200 мл исходного буферного раствора рН 7,5 вымываются балластные белки и красящие вещества. Элюирование гексокиназы проводят градиентом хлористого натрия от 0,05-1М в том же буфере, рН 7,5. Удельная активность гексокиназы после элюции 38 ед/мг. Выход по активности не ниже 70%. П р и М е р 2. Получение сорбента. 5 г аминоэтилцеллюлозы ТУ-10Н117-67 производства Олайнского завода химических реактивов, аналитической емкостью 0,26-0,45 мг-экв/г суспендируют в 1000 мл дистиллированной воды и через 30 мин жидкость с неосевшими мелкими частицами сливают. Процедуру повторяют 4-5 раз. Затем влажную массу суспендируют в 1000 мл 0,3 М раствора гидроокиси натрия. Через 1 ч жидкость с неосевшими частицами сливают, в дальнейшем декантируют водой до нейтральной реакции по лакмусу. Отг 1ытую аминоэтилцеллюлозу суспендируют в 250 мл воды и переносят в трехгорлую круглодонную колбу емкостью 500 мл, снабженную механической мешалкой и обратным холодильником. Добавляют 0,5 г хлористого цинка и 5 г В-D-глюкозы- и кипятят при перемешивании в течение 7 ч. Затем реакционную массу охлаждают до комнатной температуры, переносят содержимое колбы в однолитровый стакан, и непрореагированную глюкозу и хлористый цинк из сорбента удаляют декантацией с водой. Полученный сорбент хранят во влажном состоянии залитым водой в холодильнике при . Формула изобретения Способ выделения гексокиназы из пекарских дрожжей, включающий автолиз высушенных дрожжей в 0,2 М NajHPQj, отделение автолизата,ингибирование протеаз в автолизате обработкой фенилметилсульфофторидом и их отделение, о,, тличающийся тем, что, с целью повваиения выхода целевого продукта и сокращения про5 77 цесса его выделения, полученный после отделения протеаз автолизат подвергают хроматографии в Na-фосфатном буфере рН 7,0-7,5 на сорбенте - аминоэтилцеллюлозе j модифицированной B-D-глюкозой в степени 50-70% от начальной концентрации аминогрупп, с десорбцией фермента градиентом NaCl в концентрации 0,05-1,0 М в исходном буфере. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1126 1. С . Y . Lee. L .fj. La jarus , О.S.Kabakoff, P.Q.Russell, Gr.H.Laver N.O.Kaplan, Arch. Biochem. Biophys, 178,8, 1977. ,- 2. F.C.Womac.h, M.K.Welch, Q.Nlelson. S.P.Colowick. Очистка и феррологическое сравнение иэоферментов дрожжевой гексокиназы Р-Г и P-II, Arch. Biochem. Biophys,158, 451-457, 1973 (прототип).