Способ получения аденозин-5 -трифосфата Советский патент 1980 года по МПК C07H19/20 A61K31/7115 C12P19/32 

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения аденозин-5-трифосфата (АТФ) , который широко применяется в биологии, биохимии и медицине.

Известен способ получения АТФ путем биофосфорилирования аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганически фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола с последующим подкислениемдо рН 2,53,0 и выделением конечного продукта ионообменной хроматографией на амфотерном ионите БАК при рН 3,0,Выход трифосфата 40-45%, Чистота 95100% .1 .

Недостатком известного способа является высокий расход адсорбентавследствие невысокой рабочей обменной емкости ионита по отношению к аденозинфосфатом (40-80 мг нуклеотидов на 1 г смолы) из-за сильного влияния при рН 2,5-3,0 конкурирующих ионов фосфата, ацетата, хлорида присутствующих в реакционной смеси после отделения дрожжевого шламма. Кроме того выход целевого продукта сравнительно низок (40-45%), так

как часть аденозинфосфатов вообще не сорбируется, проходя через ионо обменную колонну при рН 2,5-3,0 в малодиссоциированном виде. Выбор рН сорбции обусловлен амфотерной природой смолы БАК, которая как анионит работает только при рН менее 3,

Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Это достигается тем, что для прекращения реакции биофосфорилирования реакционную смесь подкисляют до рН 4-,5-4,8 и ионообменную хроматографию проводят на сильнорсновной ионообменной смоле, что позволяет увеличить выход целевого продукта до 72%.

Предлагаемый способ получения аденозин-5 -трифосфата заключается в биофосфорировании аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола, с последующим подкислением до рН 4,5-4,8, в проведении ионообменной хроматографии на сильноосновной ионообменной смоле. Выход АТФ 70-72%, Чистота 96-100%,

Пример 1, 500 г аденозина растворяют в 18 л деминерализованной воды. К раствору добавляют 2170 г , 504 г 36 г КСЕ, 1 кг сахарозы, 56 г MgCEj - б HjO, 36 л пивных дрожжей и . 75О мл толуола.

Устанавливают рН 7,01 1, Т 37 ± , За ходом реакции следят по изменению рН. Время фосфорилирования 3 ч.. Для прекращения реакции добавляют ледяную уксусную кислоту дорН 4,5 и смесь охлаждают до + 4°С. Отфильтровывают дрожжевой шламм и фильтрат разбавляют 4-5 кратным объемом деминерализованной воды. Полученный раствор с рН приблизительно 4,6 наносят на колонну с анионитом,: соотношение диаметра и высоты колонны 1:4; 2,8 кг анионита АРА-5П (коэффициент набухания 2,5-3,6), После сорбции колонну промывают 50 л воды и 0,004 н. раствором соляной кислоты.

ДЦФ элюируют 0,02 н, раствором НаСев 0,01. н. нес , АТФ десорбируют 0,5 н, раствором NaCP в.0,, НС

АТФ осаждают, смешивая элюат с 10-кратным объемом этилового спирта Осадок фильтруют, растворяют в 7 л деминерализованной воды, добавляют 65 г хлористого натрия, устанавливают рН 1,8 раствором НС и смешивают с 7 л этилового спирта. Кристаллизуется динатриевая соль аденазин-5трифосфорной кислоты. Выход 680 г, Чистота 98%.

Элюат процесса сорбции направляется на выделение аденозина и АТФ для возвращения их в реакцию биофосфорилирования.

Пример 2, 25 г аденозина растворяют в 800 мл деминерализованной воды. К раствору добавляют 108,5 г Na HP04-12 Н,О, 25,2 г KHjPO, 1,8 г КСе, 1,8 г MgC X , 50 г сахара и 1,3 л пивных дрожжей,

УСЛОВИЯ фосфорилирования как и в примере 1, Реакцию прекращают добавлением ледяной уксусной кислоты до рН 4,6, Отфильтровывают дрожжевую массу, фильтрат разбавляют 4кратным объемом воды (рН 4,8) и наносят на ионообменную колонну: 0,13 кг анионита АРА-5П; соотношени дааметра и высоты колОнны 1:5, Разделение аденозинфосфатов проводят, как описано в примере 1. Фракцию АДФ концентрируют до содержания АДФ более 10%.Раствор с рН 1 смешивают 10-кратным объемом этилового спирта Осаждается натриевая соль АДФ, Выход 4,2 г. Чистота 96%,

АТФ осаждают из элюата Югкратным объемом этилового спирта, осадок отфильтровывают, растворяют в 400 МП. воды., добавляют 3,5 г хлористогонатрия, подкисляют до рН 2,3, кристаллизуют динатриевую соль АТФ добавлелием 400 мл этилового спирта ВЫХ9Д 33 г. Чистота 99%.

Формула изобретения

Способ получения аденозин-5 -трифосфата путем биофосфорилирования аденозина ферментативной системой пивных дрожжей в присутствии неорганических фосфатов, источников ионов калия и магния, углеводов и толуола с последующим подкислением и выделением конечного продукта ионообменной хроматографией, отличащ и й,с я. тем, что, с целью, повышения выхода целевого продукта, подкиление проводят до рН 4,5-4,8 и ионообменную хроматографию осуществляют на сильноосновной ионообменной смоле,. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Авторское свидетельство СССР № 395082 по заявке 1698592/31-16, кл, А 61 К 31/495, заявл. 1971 (прототип),