Способ получения аденозинтрифосфата Советский патент 1992 года по МПК C12P19/32 

Изобретение относится к биотехнологии, точнее к способу получения аденозинт- рифосфата (АТФ) с помощью клеток дрожжей рода Saccharomyces, и может быть использовано в фармацевтической промышленности и медицине для получения ле- карственных препаратов, а также для получения реактивов для научных исследований.

Известны способы получения АТФ с помощью различных микроорганизмов: пекарских дрожжей, метанольных дрожжей Candida boidinii, бактерий Brevibacterium ammoniagenes, Arthrobacter species из аденозина или аденина в среде, содержащей неорганический фосфат, источник энергии (сахар), источники ионов калия, магния, а также реагент, изменяющий проницаемость клеточных стенок микроорганизмов, например толуол, ксилол. При этом ферментатив- ные системы микробных клеток осущетвляют биофосфорилирование аденозина. Продуктом ферментативного превращения является смесь моно-, ди- и трифосфатов. Выход АТФ в смеси с другими

нуклеозидфосфатами не превышает 70%, Выделение АТФ из реакционной смеси осуществляют с применением методов ионно- обменной хроматографии.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения АТФ с помощью пивных дрожжей рода Saccharomyces, согласно которому АТФ получают биофосфо- рилированием аденозина с помощью пивных дрожжей рода Saccharomyces в реакционной среде, содержащей неорганический фосфат (0,16 М), сахарозу, источники ионов калия и магния, толуол, подкисляя среду ледяной уксусной кислотой до рН 4,5 - 4,8.

Недостатком известного способа является неполное фосфорилирование аденозина и получение смеси продуктов с содержанием 70-72% АТФ и 8% АДФ.

Целью изобретения является повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения АТФ, предусматривающему фосфорилирование аденозина

&

Ј

I

Јь ГО

о

в среде, содержащей неорганический фосфат, клетками дрожжей, используют клетки пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae и процесс ведут при содержании фосфата 0,55 - 0,85 М, поддерживая в реакционной среде рН 7,0 - 7,5.

Способ осуществляют следующим образом.

Saccharomyces cerevisiae культивируют в известных условиях на среде, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт и минеральные соли. Выращенную биомассу помещают в среду, содержащую аденозин, глюкозу, неорганический фосфат, толуол и соль магния. В этих условиях происходит полное фосфорилирование аденозина в АТФ. Оптимальными условиями для получения АТФ является концентрация неорганических фосфатов в реакционной среде 0,55 - 0,85 М и значение рН 7,0 - 7,5. При использовании концентрации неорганических фосфатов ниже 0,55 М падает выход АТФ, а увеличение содержания фосфатов выше 0,85 М нецелесообразно, так как не ведет к изменению выхода и состава продуктов. Изменение же диапазона рН выше или ниже интервала 7,0 - 7,5 приводит к снижению выхода целевого продукта.

В табл.1 приведены данные, показывающие влияние концентрации фосфатов на состав получаемых продуктов фосфорили- рования. В табл. 2 - данные, отражающие влияние рН реакционной среды на эффективность биотрансформации.

П р и м е р 1. Культивирование Saccharomyces cerevisiae 14 проводили на среде следующего состава, г/л дистиллированной воды: глюкоза 2,5; дрожжевой экстракт 2,0; KHaPCU 1,0; NaCI 1,0; MgS04x7H20 0,5; (МНфЗСМ 0,5; рН 6,5 в качалочных колбах объемом 750 мл (объем среды 200 мл) при температуре 30°С и скорости вращения качалки 180 об/мин. Выращенную в течение 20 ч культуру дрожжей

центрифугировали 5 мин при 5 тыс. об/мин. Отделенную центрифугированием биомассу переносили в реакционную среду следующего состава: 0,6 М К-фосфатный буфер

рН 7,2, 9,4 мМ аденозин; 0,5 М глюкоза; 20 мМ MgS04x7H20; 0,3% толуол (по объему). Трансформацию проводили в колбах объемом 100 мл (объем реакционной среды 25 мл) при температуре 30°С и скорости вращения качалки 200 об/мин. При этом практически весь внесенный аденозин превращался в АТФ, примеси АМФ и АДФ составляли менее 1% (степень конверсии 98,5%). Из 2,5 г/л внесенного аденозина

получено 5,1 г/л АТФ.

Анализ продуктов биофосфорилирова- ния проводили с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии на хроматографе фирмы Biorad.

Пример2. Культивирование дрожжей, центрифугирование биомассы, условия проведения биотрансформации такие же, как в примере 1, Но при этом варьировали концентрацию неорганического фосфата, а также использовали различные штаммы дрожжей.

П р и м е р 3. Культивирование дрожжей, центрифугирование биомассы, условия проведения трансформации такие же, каквпримере 1, но варьировали исходное значение рН реакционной среды.

Формула изобретения Способ получения аденозинтрифосфата

путем фосфорилирования аденозина клетками дрожжей в среде, содержащей неорганический фосфат, сахар, соль магния и толуол, отличающийся тем, что, с целью повышения степени конверсии субстрата в

целевой продукт, используют клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae и фосфорили- рование проводят при исходной концентрации неорганического фосфата в среде 0,55 - 0,85 М и рН 7,0 - 7,5.

Таблица 1

Изобретение относится к биотехнологии, а точнее к способу получения аденозин- трифосфата. Цель - повышение степени конверсии субстрата в целевой продукт. Сущность изобретения заключается в фос- форилировании аденозина клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae в реакционной среде с содержанием фосфата 0,55 - 0,85 М при рН 7,0 - 7,5. Способ позволяет получить практически 100%-ную конверсию аденозина в АТФ. 2 табл.

Таблица 2