Способ получения иммобилизированного фермента Советский патент 1980 года по МПК C07G7/02 

; -Изобретение относится к области энзимологий/а ШенноГШп йМП1Ш1М Обйлизованных ферментов,.ч : Известен способ получе1ния иммобилизованного фермента, Включайлций предварительную активацию носителя оргаНйческЪй ИЛ1И 1 еоргани«геск6й природы солями НерехЬдиь1х;мёталлОвс последуюВДйм кЬНта1ктироваНйём актйвйроваННбгб нбсйтШя ё ЙсЙ НЫ1М раствором фермента {., .Одуако известный способ не обеспечивает вЬюокий коэффициент связываний фермента/ и, кроме того, получаемьш .иммобилизованный фермент не обладает термической стабильностью и стабильностью в (растворах электролитов и денатурирующих агентов, например мочевины. ---- Целью изобретения является устранение .указанныхнёдостатков. . ,,,, .., , Поставленная цель достига.етёг еж;1№6 в качестве растворителя бОлей металлов; исйользуют. анротЬННый растворитель, а процесс иммобилиз.ации проводят йрй иёйтральны значениях рН. :; В качестре солей металла используют роли йереходных мefaллoв или алКийиШЙ; а в качестве носителя применяются йолймеры, такие как капррн, пблив.инилхлорйд; микрокристалличесййя целЖ)7ГОзтаГ Ж:Г1Гйг сокопорйстьге нёорга;ййческиё f кие -как -силОхрЬм, перлит, микрозил, -сйлякагель.,...,;. . - В качестве апроТОнНогО растворителя используют ацетон или Сульфолан. Пример 1..100лг свежепереосажденного высут ейНоТб к;аНр6на размеШивают в теченме 10-2,0 мин ъ 7,5 мл абсолютного ацетона,ДЬб.авляют 7,5 мл 3%-ногр четыреххлористого титана в ацетонеили 10%ного раствора четыреххлористого Олова В ацетоне, переМёгйивают; в Течение 1-5 мин, и выдерживают 30-40 мин. Носитель отфильтровывают, прамЫвают 10-20 МА ацетона и переносят в 5 мл раствора а-хнмотрипсина, содержащего 15 лгг фермента в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5). Смесь перемешивают 10-20 мин и выдерживают йри 2-5 С в течение 18-22 ч. Полученный иммобилизованный фермент отфильтровывают, промывают 300-500 мл 0,1 М фосфатного буфера (,5) и 300-50Ь М.Л 1 М раствора хлОрисТогО калия. Количество иммобилизованного фермента равно 30,4 мг1г носителя в случае применения четыреххлористого титана и 5;4 мг1г носителя Нслучаё- 1бтьтрех1лор1стогО олова. , Пример 2. 100 л«г .cвeжeпepeocaждeнHOfb высуШёгннОго кайрона.: размёшйВагрт р тете;нй е ;1р-20 мин в 7,5 мл абсолютного ацетона, дОбавл;яют.7,5 мл 3%-ного чети-реЖЛористого титана в ацетоне HJJH 1б%..,«,:- 1 1р-ястебр г- четЬгрш а рйстотй ацетоне, перемешивают 1-5 ;И«н и выдер, живают 30-40 мин. Носитель отфильтро/ зывают, промывают 10-20 м,л ацетона и 5 переносят в 5 мл 0,1 М фосфатного , содержащего 5,5 мг глюкбзооксидазЫ. , ., Смесь перемешнвают .10-20 лгани вьйерживают 18 ч при С, .Полученный иммобилизованный препарат отфилЬтровыва- 10 ,пр6.мыЁают 500 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора . (рН 7,5) .и 400 мл 0,1 М хлористого, калия. Колкчес.тщиммр- ,билизованного фермента равно 1,2 лгг/г носителя и 2,5 мг/г носителя, соответственно 15 й йрё :хл рйстего оЛбв и . рйстбготитана./ - - . , . Пример 3. 100 ,мг одного из высоко- пористых неоргавических. .носртеЛей сило- . .. -хройа; перелита, мйкрбзйла или., силикагеля ,20 размешивают магнитной мешалкой в 7,5 мг абсолютного сульфолана в течение 1-5 мин, лосле чего добавляют 7,5 мл 10%-ного растsopa трёхбромйСТото алюминия в сульфо.лане. Смесь перемешивают .3 Жйн; и вь1. держивают 30-40 мин. Обработанный таки,м образом носитель фиЛЬтруьЬт, пррмывазот 20 мл абсолютного сульфола на й пере-носят в 6 жл ОД Мфосфатного буферного раствора с рН 7,5, содержащего 12 мг трипсина. Потаёэт(зто смесь энергично fle ; --pfretfrl8ak)T и: ,вь1держиваютпрд °С 20 f. -Полученньга иммоб илизован1}ьш $ермёнт фильтруют, промывают 400 мл 0,1 М фосфатного. буферного раствора с рН 7,5 и 400 мл 0,1 Ж хлористого калия. Количество иммобилизованного трипсина составляет 4,3-1В,1 жг/г носителя. Пример 4. 100 2 С лохрома, перлита, микрозила или силик.агеля -тщательно размешивают в 7,5 ж.л абсолютного ацетона 10-20 мин, после чего добавляют 7,5 мл 10%-ного раствора чет&реххлориСтого олов.а д,.адетоне или 4%-ного раствора четыреххлористого титана в ацетоне. Смесь перемешива1рт 1--5 жа/f и выдерживают 40 мин. Обработанный носитель фильтруют, промывают.20 мл абсолютного ацетона и переносят в в мл фосфатного буферного ра створа (рН 7,5), содержащего 12 мг .трипсина. После этого смесь энергично перем€Цгив:ают и выдер5киБа.ют.при: температуре в течение 20 ч. Полученный иммоб иЛизованный фер;м:ент фильтруют, промывйют 400 мл 0,1 М фосфатного буферного раствора и 500 мл 0,1 М хлористого калия. Количество иммобилизованного трипсина составляет 4,3-16,1 жг/г носителя.. В та б л . 1 представлены эффективность связывания ферментами его .свойства, получаемые известным и нредл агаемЬш способами,. --... . . Таблица f.

В качестве носителяв обоих способа целлюлозу, a aKtH6atiBKi егосЗсущестБляли SnC Установлено, чтолри инкубировании иммобилизованных ферментов, получаемых tfpr утсазанных выше условиях известным и предлагаемым способШй, iffpH feSfnepaType С и рН 5,8 стабильность последних в 2,7 раза выше. -, . . v л- -:,.:...;,;.. В табл. 2 прдаедейы ср;автательные свойства иммобилизованных ферментов при инкубйрбванш йх р растворах КС1 (рН 5,8), концентрация фермента 5 жг/жл. 35х использовали микрокристаллическую U.-. - ..- .. . Т а б л и ij а Количество связанного белка, мг1г Концентрация

Аналогичная завнсимость наблюдается при ннкубирований иммобилизованных ферментов в растворах мочевины концентрации от 5,5 до 7,5 М, рН 5,8... . . .

Применение указанного способа получения иммобилизованного фермента но сравнению/с: известнйм позволяет увеличить количество связанного белка, повысить термостабильность фермента и увеличить его стабильно-сть в растворах электролитов и денатурирующих агентов.

Формула .изобретения

.. / -.г , - тем, ЧТО, с. целью гув личенйя количества связанного фермейта . и его стабильности, используют раствор соли металла в апротонном растворителе и контактирование с

раствором фермента осуществляют при нейтральных зна.чениях рН.

Источник информации, принятьга во внимание при экспертизе:

1, Патент Великобритании № 1346631, кл. С 07 G 7/02, рпублик. 1975 (прототип).