Способ получения иммобилизованных биологических активных веществ Советский патент 1980 года по МПК C12D13/10 A61K47/00 

3 эластичный гель. Его отфильтровывают, промывают 20 мл 0,1 М буферного раствора фос фата рН 7, затем дважды по 20 мл 1 М раствора NaCI и в заключение дважды по .20 мл дистиллированной воды. Измеряют объе и активность промывной жидкости. У трипсина активность определяют на основе -активности эстеразы, причем в качестве субстрата этиловый эфир бензол-L-аргинина. Измерение ведут рН-метрическим методом. При определении пеницилинацилазы в качестве субстрата применяют G-пеницилин. Единицы активности ферментов. Трипсин: I Е - количество, которое при 26°С и рН 7 в течение 1 мин разлагает 1 ммоль субстрата. Пеницилинацилаза: 1 Е - количество, которое при и рН 7,5 в течение 1 мин разлагает 1 ммоль субстрата.. . Пример 1. 49 г ангидрида малеиновой ки слоты, 78 г стирола, 21,5 г метакриловой кислоты, 0,47 г 63%-ного дивинилбензола и 1,77 г перекиси бензола размешивают в течени 3 ч при 80°С в 382 г толуола, после чего выдерживают еще 3 ч при этой температуре. Образовавшийся полимер отфильтровывают, сушат при 110°С в течение 20 ч, а затем размалывают и просеивают. Пример 2. Операции те же, что в при мере 1, но вместо стирола. используют 883 г метилстирола. Пример 3. 56,05 ангидрида итаконово .кислоты, 78 г стирола, 21,5 г метакриловой кислоты, 0,75 г дивинилбензола и 1,8 г перекиси бензоила размешивают в течение 3ч при 80°С в 400 г толуола. Полученный полимер отфильтровывают, сушат в течение 20 ч . при 110°С, а затем размалывают и просеивают Пример 4. 1г триксина (дважды перекристаплизованного, активность 9000 Ед/г) растворяют в 20 мл 0,1 М буферт ого раствора фосфата рН 7,5, а затем, при М°С добавляют 1 г сополимера, получеггаого по примеру 1. Добавкой небольших количеств 03 М раствора гидроокиси аммония поддерживают рН при постоянном значении, равном 7,5. По истечении 6 ч после добавки 14 мл 0,3 М раствора гидроокиси аммония значение рН остается постоянным, значит гидролиз прошел полностью Смола в этот период времени непрерывно набухала И к концу поглотила все количество жидкости. После этого из сополимера путем промывки удаляют не связанный фермент. Измеряют активность промывной жидкости. I промывная жидкость: 20 мл 0,1 М буферного раствора фосфата, рН 7,5; II промывная жидкость: 2x20 мл 1 М раствора NaCI lit промьшная жидкость: 2x20 мл дистиллированной воды. Трипсин: 1 г X 9000 Е/г9000Е I промывная жилкость: 20 мл X 87 Е/мл1740 Е И промывная жидкость:, 40 мл X 12 Е/мл .480 Е Ml промывная жидкость: 40 мл X 9 Е/мл360 Е . 2680 Е Вес нерастворимого фермента 1724 мг. Удельная активность нерастворимого фермента 3700 Е/г. П р н М е р 5. Операции те же, что в примере 4, но в качестве фермента используют 1 г пенншшинацилазы с удельной активностью 4400 Е/г. Пеницилинацилаза: 1 гX 4400 Е/г- 4400 Е Iпромывная жидкость: 20 мл X 40 Е/мл- 800 Е IIпромывная жидкость: 40 MJ1 X 1,3 Е/мл III промывная жидкость: 40 мл X 0,5 Н/мл -872 Е/г Вес нерастворимого фермента 1812 мг. Удельная активность нерастворимого фермента 1815 Е/г. Пример 6. Операции те же, что в примере 4, но используют 1 г сополимера, полученного по примеру 2. Вес нерастворимого фермента 1532 мг. Активность нерастворимого фермента 3067 Е/г. Пример 7. Операции те же, что в примере 4, но применяют 1 г сополимера, пол ченного по примеру 5. Вес нерастворимого фермента 1478 мг. Удельная активность нерастворимого фермента 2874 Е/г. Пример 8. Операции те же, что в примере 4, но сочетают. 1 г 1-арги ина. Вес комплекса L-аргинин-ссполимер 1632 мг. Пример 9. С сополимером связывают I г L-лизина, как это описано в примере 4. Вес комплекса L-лизин-сополимер 1592 мг. , Пример 10. С сополимером связывают 1 г глюкозамина, как это описано в примере 4. Вес комплекса глюкоэамин-сополимер 1611 мг. Пример 11. С сополимером связывают 1 г пиридоксалин-гидрпхлораиа, как это описано в примере 4. Вес комплекса пиридоксалиидигидрохлорид-сополимер 1724 мг. Пример 12. С сополимером связывают 1 кг п-аминофенилацетага ртути, как эТо описано в примере 4. Вес комплекса п-амшюфенилацетат ртути - сополимер 2021 мг. Предлагаемый способ позволяет получить целевой продукт с повышенной активностью

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованных биологически активных веществ путем ковалентното связывания биолотически активного вещества с носителем-сополимером на основе ангидрида а-/3-ненасыщенной дикарбоновой кислоты с последующим отделением и промывкой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, в качестве носителя используют тройной сополимер ангидрида а- -ненасыщенной дикарбоновой кислоты, винильного или дивинильного мономера и винилкарбоновой кислоты, причем мономер и винилкарбоновую кислоту берут в соотношении (1-4):1, а ковалентное связывание осуществляют в водной среде при рН 5,0-9,0 с постепенным щелочным гидролизом ангидридных групп.

2. Способ по п. 1, отличающийс я тем, что в качестве ангидрида 0 -|3-ненасышенной дикарбоновой кислоты используют ангидрид малеиновой, цитраконовой или итаконовой кислоты, в качестве винильного или дивинильного мономера исшльзуют стирол или метилстирол и в качестве винилкарбоновой кислоты - метакриповую или акриловую кислоту.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Патент Бельгии № 763382, кл. С 08 F, 1971.