Способ получения -рибулозо5-фосфата Советский патент 1980 года по МПК A61K31/7028 A61K35/78 

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ О-РИБУЛОЗО-Б-ФОСФАТА

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения О-рибулоэо-В-фосфата,который является ценным биохимическим реактивом Ри6улозо-5-фосфат является субстратом уникального фермента цикла Кальвина-фосфорибулокиназы. Известен способ получения D-рибулоэо-5-фосфата путем ферментативного превращения 0-рибозо-5-фосфата в присутствии высокоочишенной рибозофосфатизомеразы, выделенной из, листьев шпината, и эпимеразы при; с последующим выделением целевого продукта фракционированием эта НОЛОМ. Чистота продукта 30% 1, Недостатком известного способа получения 0-рибулозо-5-фосфата явля ются многостадийность и сложность получения двух высокоочищеиных ферментов рибозофосфатизомеразы и эпимеразы, а также невысокая чистот целевого продукта (30%). Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение качества целевого продукта., Цель достигается использованием в качестве биокатализатора экстракт листьев Phaseo us aureus, полученно при гомогенизации листьев в 0,05 М трис-НСе . буфере с рН 7,0-7,1 в присутствии . О, 2М Nace , 0,005 М этилендиамин N,N,N,К-те грауксусной кислоты (ЕДТА) и 0,1 М дитиотреитола и осуществлением ферментативного превращения при 62-65°С в течение 5-6 мин, что позволяет исключить из процесса высокоочищенные ферменты. Способ получения В-рибулозо-5-фосфата заключается в ферментативном превращении П-рибозо-5-фосфата в присутствии экстракта из листьев Phaseoftus aureus, полученного при гомогенизации листьев 0,05 М трис-HCt буфером с рН 7,0-7,1 в присутствии 0,2 М NaCft, 0,005 М ЕДТА и 0,01 М дитиотреитола, при 62-65 С в течение 5-6 мин. Чистота целевого продукта в виде бариевой соли 79,6-83,2%. Бариевая соль переводится в натриевую путем добавления к кислому раствору бариевой соли (рН 6,0-6,5) эквивалентного количества сульфата натрия с последующим быстрым замораживанием и высушиванием. Чистота натриевой соли 83%. Пример 1. Получение рибулозо-5-фосфата натрия. Выращивание Phaseotus aureus производят Haino4Be или песке с добавле727657

нием питательного раствора Прянишникова в оранжерее в течение 2-3 нед при т. 15-30 С.

Для получения экстракта листья двух-трех недельных растений гомогенизируют в течение 2 мин в 0,05 М трис-НС буфере с рН 7,0-7,1 в присутствии 0,2 Я NaCC, 0,005 М ЕДТА и 0,01 М дитиотреитола. Гр1«ргенат фильтруют через 3 слоя марли, центрифугируют при 17000 g в течение 30 мин. Поверхностную жидкость (экстракт) используют для ферментатйвного синтеза. v-Состав ферментной смеси для превращения П-рибозо-5-фосфата в D-рибулозо-5-фосфат:

трис-НСе 0,005 М,

рН 7,1, мл50

дитиотреитол 5000,

мкйоль5000

экстракт (350-400 мг

белка);

рибозо-5-фосфат,

мкмоль10000

Реакцию начинают добавлением в ферментную смесь рибозо-5-фосфс1та. Реакцию провидят в течение 5-6 мин при 62-65°С. Белок ферментной смеси ораждают 5%-ной трихлоруксусной кислотой (конечная ко нцентрация)

Результаты анализа полученного D-рибулозо-5-фосфата в виде бариевой и натриевой солей

на содержание фосфора.и ферментативную активность

Препарат

5,7

15,7

Пример 2. Получение рибулоЗО-.5-фосфата натрия.

В качестве исходного вещества для получения натриевой соли б-рйбулозо-5-фосфата используют .бариевую соль Й-рибулозо-5-фосфата. Рибулозо-5-фосфат бария растворяют в минимальном количестве бидистиллированной воды при 0-4°С. Полученный раствор доводят до рН 6,0-6,5 СОЛтюй кислотой и добавляют в него равное количество (по содержанию б.ария в П-рибулозо-5-фосфате) мкмоль ,

при 4°С. Осадок удаляют центрифугированием. Поверхностную жидкость, полученную после центрифугирования, нейтрализуют 0,5 н. NaOH до рН 6,0 и затем добавляют 20 мл уксуснокислого бария. Фракционирование D-рибулозо-5-ф6сфата производят 96%-ным этанолом. Выпал обильный осадок.После центрифугирования осадок собирают и высушивают лиофильно. Выход рибулозо-5-фосфата составил 57% или .2800 мг.

Состав ферментной смеси для проверки активности фосфорибулокинАзы в присутствии полученного D-рибулозо--5-фосфатя цистеинкарбазаловым методом, мкмрль/мл ферментной смеси: Хлористый магний .10

Дитиотреитол2

О-рибулозо-5-фосфат2

АТФ 3

трис-НСв 0,05 М, рН 7,9 40 Экстракт, сод;ержа1дий белка, мг0,5

Результаты проверки ферментативной активности, анализ полученного , П-рибулозо-5-фосфата на фосфор представлены в таблице. Анализы показали соответствие формуле

CsHeOeP На 7Hj,O

SHp

CsHgOgP Na

380 Мед/мг белка экстракта из листьев маша

Осадок сульфата бария удаляют центрифугированием. Супернатант, содержащий натриевую соль О-рибулозо-5-фосфата, быстро замораживают, высушивают сначала лиофильно, затем в вакуум-эксикаторе над при 0-4 С. Потери при переводе 0-рибулозо-5-фосфата бариевая соль в D-рибулозо-5-фосфат натриевая соль составляют около 10%....

Рззульха(й Ганалйз;а полученного Dr-pибyлbзoS-фocфaтa натриевая соль на содер жанйё фосфора (в%) и фёрмен572тативную активность представлены в таблице,.Реэу:;1ьтаты ферментативной проверки свидетельствуют о высоком качестве полученного препарата О-рибу лоэо-5-фосфата натрия. Активность 0-рибулоэо-5-фосфата в виде бариевой и натриевой солей при хранении (20°С) не снижается в течение б мес. Формула изобретения Способ получения 0-рибулозо-5-фосфата путем ферментативного превращения 0-рибозо-5-фосфата в присутствии биокатализатора при повышенной температуре с последующим выделением целевого продукта фракционй76рованием этанолом, .о т л и ч ающ и и с я ;тём,что, с целью упрощения процесса и улучшения качества целевого продукта, в качестве биокатализатора используют экстракт листьев Phaseo(ius aureus, полученный при гомогенизации листьев в 0,05 М трис-НСС буфере с рН 7.,0-7,1 в присутствии. 0,, 0,005 М этилендиамин К,М,1;1,Ы-тетрауксусной кйслоты и 0,01 М дитиотреитола, И ферментативное превращение осуществляют при 62-б5 С в течение 5-6 мин. Источники информации, принятые во вниманиие при экспертизе 1. B.L. Horeck r. Preparation., and analysis of ribuSose-5-phosphate,-. Methods in Enzymo ogy, 3, с. 190192 (1957) (прототип).